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《植物學報》2016年第一期

摘要

水稻(yzasativa)是我國最重要的糧食作物之一,在保障國家持續的糧食供給中扮演著重要角色。根系作為水稻生長發育必不可少的器官,間接地決定著水稻地上部產量、品質、抗逆及廣適性等諸多農藝性狀的表現。近年來,隨著水稻根系法的不斷改進和圖位克隆技術的完善及廣泛應用,水稻根系研究也取得了較大進展,并已成功定位、分離、克隆了一些控制水稻根系的相關基因。該文從水稻根系法、相關性、基因定位、克隆及功能解析等層面綜述了國內外水稻根系的研究進展,并闡述了水稻根系研究存在的問題和今后研究的重點。

關鍵詞

水稻,根,根系法,相關性,圖位克隆

中國是世界上最大的稻米生產與消費國,不斷增加的人口數量使對稻米的需求與日俱增,千方百計地提高水稻(yzasativa)單產和總產,對保障國家糧食供給、促進社會穩定和諧具有十分重要的戰略意義。20世紀50年代的水稻高稈變矮稈育種、70年代的水稻雜種優勢利用育種以及1996年由農業部發起的超級稻育種計劃為提高水稻產量作出了重大貢獻(程式華,2010)。這些育種計劃的具體策略主要是根據水稻地上部眾多重要農藝性狀,如產量、品質、抗逆及廣適性等的遺傳表現來選配優良親本,配制強優勢雜交組合來提高水稻的產量(峰,1996;程式華,2010)。然而,在數以百計的水稻農藝性狀中,根系承載著眾多生理生化功能,如吸收水肥、固定植株和合成運輸物質等,同時根系與眾多地上部農藝性狀的遺傳表現息息相關(Liangetal.,2011)。但水稻根系因不能被人們直接收獲食用故根系性狀不被重視,人們對水稻根系性狀的認識深度與廣度遠不及對于地上部產量與品質性狀,其基礎理論與應用研究嚴重滯后,根系雜種優勢的利用研究尚處于探索階段。如何從根系著手打破當前水稻單產徘徊不前的局面,或許將成為21世紀超級稻育種計劃的新課題。

近年來,隨著水稻全基因組測序計劃的成功實施(Yuetal.,2002),基因圖位克隆技術的完善與廣泛應用(Coulsonetal.,1986;Tanksleyetal.,1995),生物信息學軟件的不斷研發(Lincolnetal.,1992;Wangetal.,2006;Yangetal.,2009),農桿菌介導的水稻轉基因技術體系的成功搭建(Chanetal.,1993;Hieietal.,1994;李雙成等,2005),水稻根系研究法的不斷改進(宋祥甫,2001;顧東祥等,2010;張建鋒等,2012),這些技術的不斷發展必將推動水稻根系研究進程。迄今為止,國內外科學家成功分離和克隆了一系列水稻根系性狀相關基因(QTLs),諸如ARL1(Liuetal.,2005)、WOX11(Zhaoetal.,2009)、qRL7(Liangetal.,2013)和DEP1(Huangetal.,2009;Sunetal.,2014)等。因此,借助現代分子生物學的理論與技術體系開展水稻根系性狀相關基因的定位、分離和克隆研究,篩選優異的根系基因資源,逐步實現水稻根系基因設計育種,提高水稻育種效率指日可待。為此,本文將結合水稻根系育種提高水稻單產和總產的總體目標,重點介紹國內外水稻根系法、相關性、基因定位和克隆等方面的研究進展,以期為水稻根系遺傳基礎理論和育種應用研究提供參考。

1水稻根系研究方法

水稻根系研究始于1923年,美國植物生態學家Weaver首次使用挖掘法開展水稻根系研究,開創了水稻根系研究的先河。縱觀國內外水稻根系法研究的發展歷程,總體上可將水稻根系法歸納為兩大類,即機械挖掘法和非挖掘法。機械挖掘法包括原狀土柱法(伯姆,1985)、網袋法(LehmanandEngelke,1991)、簡易根箱法(Turmanetal.,1995)、塑料管土柱法(Kristian,1998)。該方法的優點在于可獲得保持原有土壤生長形態的根系,可準確可靠地展現水稻根系在土壤中的自然分布情況,幫助人們客觀真實地了解根系在土壤中的生長特征。非挖掘法包括同位素示蹤法(王福鈞,1993;陳子元,1997)、霧培法(劉士哲,2001)、桶(盆)缽栽培法(廖興其,1995)、砂培法(劉士哲,2001)和水面無土栽培法(宋祥甫,2001;吳偉明和程式華,2005)。非挖掘法的優點是在不損傷根系的前提下可獲得完整的水稻根系,便于準確測量根系性狀的表現值,為根系定量研究提供了方便,彌補了機械挖掘法損傷根系的不足。在水稻根系研究計劃實施過程中可根據不同研究目標兼顧機械挖掘法和非挖掘法的優缺點來選用具體研究方法。近年來,水稻水面無土栽培法、根系(WinRHIZOLA6400XL)掃描以及根系(WinRHIZeg2009C)分析軟件的成功開發與廣泛應用將根系研究推向了新階段(顧東祥等,2010;張建鋒等,2012)。該方法在不斷創新利用中可較準確地測定過去用常規方法難以測定的根系性狀值,如總根長、根表面積和根直徑等。綜上所述,水稻根系研究方法經過近100年的發展,經歷了從最初的簡單粗放研究到當前復雜根系性狀的精準測定研究的發展歷程,極大地豐富和拓展了根系研究的廣度和深度,這將為水稻優異根系資源的篩選、鑒定、根系基因定位、克隆及根系分子設計育種提供準確的表型數據,必將加速水稻根系基礎理論與應用研究進程。

2水稻根系性狀與其它性狀的相關性

縱觀國內外學者圍繞水稻根系性狀的相關性研究報道,發現迄今為止,這些研究大多選用有代表性的栽培水稻品種為材料,開展水稻根系性狀間以及根系與其地上部農藝性狀的相關性研究。但選用水稻遺傳群體(RIL或DH)在成株期(抽穗期)開展根系性狀與地上農藝性狀的相關性研究報道較少,特別是成株期水稻根系性狀間相關性的研究報道更少。凌啟鴻和凌勵(1984)研究證實了水稻生育中、后期的上、下層根系性狀分別與對層穗數、穗穎花數及光合產物等性狀有一定程度的相關性。Mita等(1986)研究發現,水稻根系性狀與地上部產量性狀間存在顯著相關。陸定志(1987)證實了雜交稻汕優6號在抽穗期和乳熟期其根系傷流強度與葉片老化指數呈極顯著正相關,與穎花數、結實率和千粒重呈不同程度的正相關。石慶華等(1997)研究了12個不同穗型水稻品種的根系形態特征與地上部農藝性狀的相關性,并證實了根數、根重和根直徑等性狀分別與地上部產量性狀存在顯著相關。峰等(2001)在水稻穗分化期和開花期選用切根法研究切根對雜交稻組合65002與汕優63的生長和產量及構成因子的影響,證實了切根對大穗型品種籽粒產量影響大于小穗型品種,穗分化期切根的影響大于開花期。鐘旭華和黃農榮(2005)選用不同堊白的秈稻品種為材料開展結實期根系活性與堊白的關聯性研究,證實了結實期根系活性與堊白米率、堊白度呈負相關,庫容根活量直接影響堊白,而堊白受根系α-萘胺氧化力和穎花根活力的影響較小。何強等(2006)選用砂培法研究了10個雜交稻組合苗期發根性狀與生育后期根系生理指標(SOD和TTC)與穗部性狀的關系,證實了苗期發根數、發根鮮重和發根力與孕穗期根系TTC還原力和結實率呈極顯著正相關,發根數還與乳熟期SOD活性呈極顯著正相關,與齊穗期TTC還原力呈顯著負相關;發根鮮重和發根干重分別與穗部性狀密切相關。Kanbar等(2009)研究發現不同水環境下根長和根數均影響水稻的產量性狀。梁永書等(2011)研究了超級稻協優9308衍生群體成株期(抽穗期)的根系相關性,證實了根系性狀,如根長、總根長、根干重等多類性狀間存在顯著相關,同時也證實了根系性狀分別與地上部農藝性狀(如株高、穗數和單株產量等)存在顯著相關。總之,水稻根系性狀的相關性研究目標不能僅停留在根系性狀與其地上部農藝性狀間的表觀認識,其深層次意義在于通過性狀間表現相關性研究,實現分析其內在基因間聯動性的總目標,拓展水稻根系性狀相關性研究的內涵和外延。

3水稻根系性狀的QTL

經典遺傳分析表明,絕大部分水稻根系性狀屬于多基因控制的數量性狀(quantitativetraitloci,QTL),數量性狀基因研究法區別于質量性狀基因之處在于將多個數量性狀基因位點解析為單個孟德爾遺傳因子。具體實施步驟為:首先構建水稻遺傳群體和分子遺傳圖譜,開展QTL初定位;其次借助初定位結果標記信息,構建高世代回交群體,并在目標區間構建高飽和度的遺傳物理圖譜,開展QTL精細定位;最終克隆QTL(Yuetal.,2002;Xueetal.,2008)。自從Champoux等(1995)首次發表水稻根系性狀的QTL定位研究以來,目前已定位了數百個根系性狀相關QTLs,從1995–2004年僅GrameneQTLs(www.gramene.g)收錄的QTLs信息多達732條,覆蓋水稻全基因組12條染色體,這些QTLs主要來自水稻IRRIM/CO39(Champouxetal.,1995)、IRRIPal/IR42(Taoetal.,1999)、IRRIIR64/Azu(Hemamalinietal.,2000)、TTUIR58821/IR52561(Alietal.,2000)、AberdeenBala/Azu(Price,2000)、CTIRCT9993/IR6226(Zhangetal.,2001)、IGCNZYQ18/JX17(Xuetal.,2002)、CNHZAUZh97/Ming63(Cuietal.,2002)、CNZUIR1552/Azu(Zhengetal.,2003)、CN-HZAUZh97B/Mil46(Yanetal.,2003)、IRRIIR64/ufi(Nguygenetal.,2003)及JUTAkihi/IRAT109(Hiietal.,2006)等遺傳群體。總結歸納現有水稻根系QTL定位研究成果,不難發現,選用當前農業生產上主推的雜交稻,尤其是選用超級稻骨干親本為研究材料構建遺傳群體來開展根系QTL定位的研究報道較少。從生育期來看,水稻苗期根系性狀的QTL定位研究報道較多,水稻成株期(如分蘗中后期、抽穗期和齊穗期等重要生殖生長后期)完整根系性狀的QTL研究報道較少。

由表1可見,按照水稻根系QTL染色體分布劃分,定位在第1、2和9號染色體上的根系QTL數目較多,分別有105、116和74個,第10號染色體最少,僅為16個。根據定位結果進行統計分析,第1和2號染色體為根系QTLs分布的熱點區域。按照根系性狀劃分,根干重、根厚和根長3類性狀的QTL定位數目最多,分別有125、114和96個,對這些根系性狀考查容易,可簡單快捷地獲得表型數據,因此報道較多。根分枝QTLs報道較少,僅為3個。目前,水稻根直徑、根表面積和根尖數等性狀表現值考查難度較大,尚未見相關QTL的研究報道。從水稻根系性狀QTL定位結果來看,相同性狀能定位在水稻的不同染色體上(表1),而在同一染色體相同標記區間同樣可能檢測到不同類型的根系QTL。因此,根系QTL同樣存在熱點區域分布特征,即一因多效QTL(Kongetal.,2006)。如在水稻第1號染色體上,AberdeenBala/Azu(Price,2000)群體的C86–C949(37713253–39813293bp)標記區間202.6–221.9cM遺傳圖距范圍內重復檢測到控制根干重、根數和根厚3類性狀的QTLs。又如在水稻第2號染色體上,CnellIR64/Azu(Hemamalinietal.,2000)群體在RG171–RG157(17484665–19865083bp)標記區間重復檢測到控制根長、根干重和根冠比3類性狀QTLs。Liang等(2012,2013)在超級稻協優9308衍生群體第7號染色體短臂上RM180–RM5436(5735196–9074712bp)區間重復檢測到控制成株期(抽穗期)根長、總根長、根重、株高、穗數和單株產量等諸多性狀的QTLs。在水稻不同遺傳群體的相同標記區間重復檢測到不同類性狀QTLs反映出該QTLs穩定遺傳且具有一因多效性。已有Ghd7基因的成功分離和克隆證明了一因多效基因存在的真實性(Yuetal.,2002;Xueetal.,2008;談聰等,2012)。因此,對于控制多類性狀的QTLs能在相同標記區間高頻重復檢測到,在開展分子標記輔助選擇時可通過一個性狀的選擇,同步選擇多類性狀,同樣可以通過一個基因的遺傳改良同步改良多個農藝性狀,達到事半功倍的效果。這必將加速重要農藝性狀基因定位、克隆及分子標記輔助育種的研究進程。

4水稻根系性狀相關基因的克隆和功能分析

目前,國內外科學家大多采用圖位克隆技術對水稻基因進行定位、分離和克隆(姜樹坤等,2008),借助國際水稻全基因組測序計劃研究成果(Yuetal.,2002),通過構建臨時性水稻遺傳群體(F2)或永久性遺傳群體(RIL或DH),繪制水稻全基因組遺傳圖譜開展水稻根系QTL初步定位研究。在初步定位結果的基礎上選擇遺傳效應值較大的主效QTLs,針對目標區間染色體片段構建高世代回交群體,開展QTL精細定位(物理距離小于40kb,目標區間預測基因5個左右),獲得目標基因緊密連鎖的分子標記。借助水稻基因注釋信息網站(www.gramene.g)和rice.plantbiol-ogy.msu.edu獲取目標候選基因序列信息,設計引物和PCR擴增候選基因全長(completegenomicse-quence或CDS),測序比較分析候選基因的堿基突變位點,通過遺傳互補實驗確立候選基因的功能。2002–2014年,國內外水稻分子生物學家分別克隆了控制水稻短根基因FPF1(Yaoetal.,2004)、不定根形成基因ARL1(Liuetal.,2005)和根冠形成基因WOX11(Zhaoetal.,2009)等多個根系性狀相關的基因(表2)。IRT1(Naimatullahetal.,2002)是一個控制水稻根系鐵吸收轉運的基因,過量表達該基因能增強水稻根系吸收土壤中Fe2+的能力,該基因cDNA序列全長1395bp,編碼374個氨基酸。Rrl3(Inukaietal.,2003)是一個控制機械刺激響應基因,調控水稻根分生區的細胞生長分化進程。Srt5(Yaoetal.,2004)是一個控制水稻苗期短根的基因,該基因受外源性蔗糖、葡萄糖和果糖等正向調控,促進根系生長。

OsPTF1(Yietal.,2005)是一個控制磷饑餓的轉錄因子,過量表達該轉錄因子能提高轉基因水稻植株忍受磷饑餓的能力,突變體磷含量比野生型高30%。SKC1(Renetal.,2005)是一個編碼HKT轉運蛋白成員的基因,在木質部維管束周圍薄壁組織細胞中表達,Na+選擇性轉運蛋白,在鹽脅迫下調節體內K+/Na+平衡。OsGNA1(Jiangetal.,2005)是一個編碼葡糖胺-6-磷酸乙酰轉移酶的基因,攜帶該基因的水稻苗期根系在25°C下不生長,但在32°C條件下恢復生長;該基因編碼165個氨基酸,2個(AT)重復基元分別在101–125和145–154氨基酸之間。ARL1(Liuetal.,2005)是一個控制不定根系形成、響應生長素和乙烯調控的基因。ARL1基因突變位點發生在第2個外顯子內+421–+440bp區段,有20bp堿基序列發生缺失,與野生型相比,僅編碼155個氨基酸,有104個氨基酸提前終止而未成功編碼氨基酸。LsiL(Maetal.,2006)是一個控制水稻硅吸收及轉運的基因,缺失該基因后水稻根系硅儲運量降低;該基因堿基序列全長1409bp,編碼298個氨基酸,突變位點發生在外顯子132bp處,由野生型丙氨酸編碼成突變型的蘇氨酸。WOX11(Zhaoetal.,2009)是一個控制根冠發育的基因,過量表達該基因會加速根冠細胞分化,導致水稻外層干節點的早期根冠生長和根冠生產,影響水稻生長素和細胞分裂素信號轉導。DEP1(Huangetal.,2009)是一個控制水稻穗粒數的基因,該基因提高了分生組織的活動,導致花序節間長度減少。其突變基因發生在LOC_Os09g26999外顯子5中,637bp堿基序列被12bp序列所替代,導致編碼提前終止;C末端230個氨基酸殘基缺失,經轉錄翻譯成磷脂酰乙醇胺結合蛋白。Sun等(2014)研究證實攜帶有DEP1基因的水稻植株耐高氮營養生長,氮吸收和同化效率較高。該基因同時還控制水稻地上部的產量性狀,扮演著雙重角色,屬于一因多效基因克隆研究的成功典范。歸納總結前人的研究報道不難發現,前人對根系性狀的基因克隆研究大多停留在根系層面,忽視了根系性狀相關基因是否影響地上部農藝性狀。因此,要將根系性狀相關基因的定位、分離和克隆研究成果整合到地上部農藝性狀,如產量、品質和抗性研究計劃中,才能更好地將根系性狀相關基因克隆研究成果應用于未來超級稻育種計劃中。

5研究展望

5.1加強超級稻骨干親本成株期根系基礎性研究近年來,國內外學者在實施水稻根系性狀相關基因的定位、分離和克隆計劃時通常選用苗期根系突變體為材料,水稻苗期根系性狀不能很好地表征水稻成株期根系的性狀特征。因此,選用水稻突變體材料苗期根系性狀進行基因克隆的研究成果難以服務于當前的超級稻育種計劃,難以將現有研究成果整合到超級稻分子育種研究計劃,加之人們對水稻成株期(抽穗期)根系形態性狀的遺傳特征知之甚少,尤其是對超級稻骨干親本成株期根系性狀的遺傳規律認識不夠深入,制約了超級稻根系育種項目的順利實施。當前,超級稻育種在保障國家糧食安全中作用重大,但對超級稻骨干親本成株期根系的遺傳研究相對滯后,成株期根系的遺傳表現最能表征水稻根系性狀的特征特性。國家農業行業科研專項資金和國家水稻產業技術體系均把超級稻育種列為解決國家糧食可持續供給的首要舉措。目前超級稻育種的核心仍然是根據地上部重要農藝性狀的遺傳表現來篩選優質親本系、配制強優勢雜交組合,從而實現高產、優質、多抗和廣適等眾多優良性狀集聚于同一品種的育種策略(鄒江石和呂川根,2005;馮榮坤,2006;程式華,2010)。然而,在超級稻育種實踐中,人們往往忽視了其骨干親本成株期根系性狀的遺傳基礎性理論研究。因此,在今后的水稻根系研究計劃中,應加強超級稻骨干親本成株期根系基礎性理論研究,其具體舉措就是加強超級稻骨干親本資源整合和加速遺傳群體構建,運用圖位克隆技術挖掘控制超級稻骨干親本成株期根系性狀的新基因,最終闡明超級稻骨干親本根系性狀與其產量性狀形成的關系,尤其是強優勢雜交組合的根系特征特性,如根系性狀分別與水肥吸收、產量、品質、耐逆性等眾多性狀間的相關性。

5.2加強根系與地上部農藝性狀間基因水平的聯動性研究近年來,國內外學者研究證實了水稻地上部農藝性狀與根系性狀間存在不同程度的相關性(石慶華等1997;Liangetal.,2011),水稻農藝性狀的外在表型間存在相關性,其內在遺傳基因間同樣存在著聯動性,即農藝性狀表型相關,其基因型亦相關。如Ghd7基因不僅控制水稻的株高、抽穗期、產量、劍葉長度和葉面積等,而且這些性狀外在遺傳表型間同樣存在顯著相關性,其內在的基因間完全相關——Ghd7為一因多效基因(Yuetal.,2002;Xueetal.,2008;談聰等,2012)。同樣,DEP1基因不僅控制水稻直立穗密度性狀,而且還控制水稻根系氮元素的吸收同化(Huangetal.,2009;Sunetal.,2014)。Liang等(2012,2013)研究證實水稻根系性狀分別與地上部農藝性狀,如生育期、株高和產量等眾多性狀間存在相關性,其基因重復定位在相同染色體的同一標記區間。這些成功的研究實例證實了水稻根系性狀與地上部農藝性狀間不僅在表型上存在聯動關系,而且在基因型水平上也存在聯動性。因此,在今后水稻研究計劃實施過程中,我們有望將現有水稻基因組學研究的成果整合到水稻根系育種研究計劃中,從而加速水稻根系超級稻育種研究進程。目前,僅GrameneQTL(www.gramene.g)網站上有關水稻農藝性狀的QTLs就有8646條信息,這些QTLs絕大部分控制水稻地上部農藝性狀,且大多數已報道的QTLs處于初步定位階段,尚未完成精細定位,難以獲得其功能驗證結果。當前,我們對這些初定位QTLs的詳細信息知之甚少,是否真實存在同時控制根系性狀和地上部農藝性狀的聯動性QTLs仍不清楚。因此,在今后的水稻根系研究計劃中必須加大水稻地上部農藝性狀與根系性狀基因間聯動性研究的投入。只有充分理解水稻根系性狀與地上部農藝性狀間的聯動性,方可將現有水稻基因組學研究的成果整合到根系育種計劃中,實現控制水稻根系性狀與地上部農藝性狀在基因水平上的有機統一,才能發揮根系研究在未來超級稻育種中的重要作用。

作者：梁永書 周軍杰 南文斌 段東東 張漢馬 單位：重慶師范大學生命科學學院 植物環境適應分子生物學重慶市重點實驗室