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摘要：線粒體是真核細胞中參與細胞代謝和細胞程序性死亡的重要的細胞器。除此之外，線粒體還與宿主細胞抗病毒先天性免疫有密切的關系。線粒體首次被證實參與先天性免疫調控是線粒體抗病毒信號蛋白（MAVS）的發現，MAVS錨定于線粒體，是RIG-I樣受體信號傳導中的關鍵接頭蛋白。最近，其他先天免疫分子，如NLRX1，TRAF6，NLRP3和IRGM等也被證實與線粒體相關，說明線粒體能夠作為先天性免疫的平臺發揮抗病毒作用。此外，損傷線粒體可釋放一系列損傷相關分子模式，其中線粒體DNA（mtDNA）的釋放能夠激活TLR9，NLRP3和STING等一系列先天性免疫信號通路。本文簡單介紹了線粒體的功能，總結了線粒體如何調控抗病毒先天性免疫，試圖為細胞器水平進行病毒防控提供新策略。

關鍵詞：線粒體;病毒;先天性免疫;MAVS;線粒體DNA

線粒體是真核細胞中一種重要的雙層膜結構的細胞器，除了成熟的哺乳動物紅細胞和某些單細胞生物之外，線粒體幾乎存在于所有真核生物細胞中。線粒體最初被發現也是最重要的功能是通過呼吸鏈產生能量，即三磷酸腺苷（ATP）。ATP產生最重要的通路是三羧酸循環，線粒體內膜上的大量蛋白質參與了這一過程，因此線粒體被認為是細胞的動力工廠。線粒體另一個重要的功能是儲存細胞中的鈣離子，線粒體能夠迅速攝取鈣，并稍后釋放，線粒體的這種瞬時儲存鈣的功能有利于維持細胞內的鈣穩態[1]。細胞中游離鈣的濃度可調節一系列反應，對細胞中的信號轉導至關重要，由線粒體膜電位驅動的鈣釋放可以激活一系列第二信使，協調神經細胞中的神經遞質釋放和內分泌細胞中激素釋放的過程[2]。除此之外，線粒體還在其他一些細胞代謝中發揮重要作用，例如：線粒體活性氧介導的信號轉導，細胞凋亡、激素信號傳導等。近年來，隨著線粒體抗病毒蛋白（Mitochondrialantiviral-signalingprotein,MAVS，又稱IPS-1,VISA,CARDIF）[3-6]的發現，越來越多的證據顯示線粒體在先天性免疫中發揮重要的作用，本文就線粒體如何參與抗病毒先天性免疫進行綜述。

1線粒體動力學和抗病毒免疫

病毒感染細胞時，先天免疫系統通過幾種類型的模式識別受體（PRR）快速識別病毒，這些識別病毒的PRR主要包括Toll樣受體（TLR）和RIG-I樣受體（RLR）。TLRs（例如TLR7和TLR3）位于細胞膜或細胞內體的膜上，識別病毒的病原相關分子模式（PAMP）后招募接頭蛋白（例如MyD88和TRIF），導致下游信號通路的激活，產生I型干擾素（IFNs）和趨化因子[7]。RLR（例如RIG-I和MDA5）是細胞質中識別病毒的模式識別受體[8][9]。這些胞質解旋酶含有兩個N端串聯的半胱天冬酶招募結構域（caspaserecruitmentdomain，CARD）[8][10]，RLR識別病毒后會發生構象變化導致CARD域的暴露，與下游線粒體接頭蛋白MAVS的CARD結構域產生互作，隨后激活下游的兩種細胞質蛋白激酶復合物，一種包括“非經典”IKK-相關激酶TBK1或IKK-i/ε和一系列接頭蛋白例如TANK,NAP1和NEMO。這種TBK1復合物負責激活轉錄因子IRF3的磷酸化和二聚化，IRF3轉位至細胞核中，誘導I型IFN基因的表達。另一種激酶復合物包括IKKα,IKKβ和NEMO，這種IKK復合物激活NF-κB，促進下游促炎性細胞因子的表達，參與先天性抗病毒反應[5,8]。用Poly(I:C)刺激MAVS缺陷小鼠無法引起IFN產量上升，RNA病毒感染MAVS缺陷小鼠后導致免疫反應嚴重受損[11,12],這些結果說明MAVS在抗病毒先天免疫中發揮關鍵作用。MAVS如何參與介導抗病毒先天免疫信號的傳導的具體機制尚不清楚，但重要的是，MAVS必須定位于線粒體才能發揮其功能[5]，說明MAVS的信號傳導依賴線粒體的狀態。與之相對應的是：MFN1作為一種線粒體融合蛋白，能夠正調控MAVS介導的天然抗病毒反應[13-15]。進一步研究結果顯示MAVS能與MFN1發生相互作用，RLR激活后，MFN1-MAVS復合物調控線粒體上MAVS的重新分配以及線粒體的管網狀延伸[14,15]。盡管MAVS再分配的功能尚不明確，但線粒體的管網狀延伸能夠增強MAVS與STING的互作，促進細胞抗病毒反應[14]。STING是位于內質網膜的抗病毒信號接頭蛋白，在DNA病毒誘導的先天性免疫中發揮重要作用[16]。與MFN1相反，其同源蛋白MFN2卻能夠抑制MAVS功能，這可能與線粒體動力學無關[17]。因此，盡管MFN1和MFN2在線粒體融合方面具有相似的功能，但它們在抗病毒先天免疫方面似乎起著相反的作用[13]。MFN1和MFN2兩者除了對線粒體融合的調控外，還能夠與各自的伴侶分子在線粒體外膜上進行同型和異型互作，這確保了對MAVS介導信號傳導的精細調控。MAVS介導的抗病毒信號傳導不僅受線粒體動力學的調控。兩種線粒體蛋白，NLRX1[18]和gC1qR[19]被證實通過抑制MAVS阻斷RIG-I和MDA5介導的抗病毒反應。有趣的是，最近的一項研究報導顯示線粒體膜電位（ΔΨm）也能調控RLR介導的先天性免疫通路[20]。用質子載體CCCP處理或在MFN1和MFN2缺失的細胞中ΔΨm喪失，這明顯阻斷RLR介導的抗病毒先天免疫應答，但對TLR3的激活沒有影響。ΔΨm在MAVS介導的信號傳遞中的具體作用還不明確，有報道認為ΔΨm的喪失可能會阻止MAVS復合體的重組，MAVS復合體的重組能為病毒感染提供更迅速的反應[20]。此外，ΔΨm的喪失還有可能阻止MAVS與STING的互作[14,16]。這些證據證明線粒體動力學和ΔΨm似乎都參與了MAVS介導的先天性免疫，但是將線粒體最重要的功能ATG合成抑制卻并不阻斷MAVS介導的信號傳導，說明MAVS的功能不依賴于線粒體的能量供應。除了直接調控之外，線粒體還能夠通過活性氧（ROS）間接調控先天免疫信號通路，例如NF-κB和JNK途徑，以及caspase1炎性小體[21]。細胞內活性氧的兩個主要來源是線粒體和膜相關的NADPH氧化酶（NOX）與雙重氧化酶（DUOX）復合物。NOX2和ROS對MAVS介導的抗病毒信號傳導至關重要。進一步研究結果證實NOX2對于MAVS的表達至關重要，NOX2下調能降低MAVS的mRNA表達水平而不影響其線粒體定位[22]。

2線粒體作為先天免疫的平臺

MAVS作為RLR通路的樞紐接頭蛋白定位于線粒體外膜，且MAVS發揮功能依賴其線粒體定位，首次證實了線粒體在先天免疫信號通路中發揮重要作用。越來越多的證據證明許多宿主抗病毒免疫反應都依賴于線粒體。許多參與細胞免疫反應的分子均與線粒體關系密切，例如NLRP3，TLR等。

2.1NLRP3

NLRP3是一種重要的NLR（NOD樣受體），在病原相關分子模式（PAMP）和損傷相關分子模式（DAMP）誘導caspase1炎性小體過程中發揮重要作用[23]。NLRP3上游激活物的多樣性導致了NLRP3能識別由PAMP和DAMP觸發的信號，而不是直接識別單獨的分子（蛋白質或核酸等）。這依然存在爭論，因為證據表明溶酶體損傷或者ROS可以直接作為NLRP3的激動劑。最初發現由NADPH復合體產生吞噬體相關ROS能激活NLRP3[24]。另有報道顯示，細胞中NADPH氧化酶依賴的ROS產生通路受阻能夠導致NLRP3通路激活[25]。JürgTschopp組最近提出線粒體可能是激活NLRP3的ROS的主要來源，為這些相互矛盾的結果提供了可能的解釋[26]。他們發現魚藤酮和抗霉素這兩種藥物能夠阻斷線粒體呼吸鏈，導致線粒體ROS的生成，從而有效激活NLRP3。類似地，抑制自噬能導致產生ROS的缺陷線粒體積累，而該線粒體又能增強NLRP3依賴炎癥小體的激活。進一步研究結果表明，線粒體作為一種分子平臺，在NLRP3激動劑處理后能招募NLRP3中的幾個炎性小體成員，包括NLRP3本身和接頭蛋白ASC[26]。但是目前對產生ROS的線粒體如何招募NLRP3炎性小體的機制仍然未知，對線粒體錨定相關復合物如何參與NLRP3炎癥小體形成還有待進一步研究。

2.2TLRs

吞噬細胞吞噬細菌后導致多種先天免疫信號通路的激活并殺死微生物。ROS的產生是消滅微生物的一種最古老而有效的手段，它是通過上調位于吞噬體表面的NADPH氧化酶復合物，從而實現與吞噬作用的功能互聯。TLR信號能增強NADPH氧化酶活性，而由該復合物產生的ROS能增強TLR介導的炎癥途徑[27]。最近的一項研究表明線粒體也可能在吞噬相關的ROS生成和TLR信號轉導方面起著關鍵作用。研究結果表明：用細胞表面TLRs包括TLR1，TLR2和TLR4的配體，能激活鼠巨噬細胞產生線粒體衍生的ROS，而內體上的TLRs包括TLR3，TLR7，TLR8和TLR9的配體則不能激活鼠巨噬細胞產生ROS[28]。有趣的是，當細胞吞噬了包被Pam3CSK4（TLR2配體）或LPS（TLR4配體）的乳膠微球后，細胞中線粒體聚集在含有乳膠微球的吞噬體附近，而當乳膠微球包被CpGDNA（TLR9配體）時，則沒有觀察到類似的現象。由此可以推斷微生物的吞噬和TLR識別導致吞噬體周圍線粒體的聚集和局部ROS產生，這有助于消除被吞噬的微生物。進一步研究結果表明：TRAF6是TLR信號通路中至關重要的E3連接酶，在TLR1/2/4配體（而非TLR3/9配體）處理細胞后轉運至線粒體，而線粒體ECSIT蛋白被鑒定為TRAF6的泛素化靶標蛋白，而該泛素化是被TLR1/2/4配體特異性激活的。線粒體中TRAF6-ECSIT通路的激活對線粒體在吞噬體附近的特異性定位以及線粒體ROS的誘導至關重要。以上研究突出了線粒體ROS在吞噬微生物方面重要性，TRAF6-ECSIT通路的例子說明線粒體在先天性免疫中發揮樞紐作用[28]。

2.3NLRX1

NLRX1是NLR家族成員中唯一一個具有N末端線粒體定位序列的蛋白，該區域被命名為字母“X”[18,29]。生化分析結果顯示NLRX1定位于線粒體基質[30]。值得注意的是，NLRX1是目前已知的唯一的靶向線粒體的PRR家族成員，暗示了NLRX1可能連接線粒體和先天免疫之間的重要“橋梁”。然而NLRX1的線粒體定位特征表明其似乎并不能直接識別微生物來源的分子標記。因此，NLRX1的確切功能尚不清楚。NLRX1的過表達能誘導ROS的產生[29]，可能原因是NLRX1與UQCRC2發生互作，而UQCRC2是線粒體呼吸鏈復合體Ⅲ的重要組分，在ROS生成中具有關鍵作用[30]。有趣的是，NLRX1被證明也能與MAVS互作，抑制MAVS依賴性的抗病毒反應[18]。但是，NLRX1具體如何與MAVS互作仍不清楚，因為這兩種蛋白質定位于不同的由雙層膜隔離開的線粒體亞結構域。NLRX1進入線粒體依賴一定程度的內膜ΔΨm[30]，因此ΔΨm的損耗將導致NLRX1在細胞質中滯留，滯留在細胞質中的NLRX1與MAVS互作并抑制其介導的信號通路，這個假設還有待進一步證實，首先需要確定病毒感染能否誘導NLRX1在胞質中的滯留。另一種可能性是NLRX1通過產生ROS影響RLR信號傳導，因為ROS已經被證明能調控MAVS依賴的信號通路[22]。

2.4IRGM

IRGM是一種細胞中廣泛存在的的人類鳥苷三磷酸酶，在先天免疫抵抗細胞內病原方面發揮作用[31]。相對于許多鼠源IRG基因由干擾素調節，人源只存在兩種直系同源基因IRGM和IRGC。IRGM最初被認為是一個假基因，后被發現在人類巨噬細胞清除結核分枝桿菌過程中發揮作用[32]。具體來說，IRGM已經證明在雷帕霉素，饑餓和IFNγ誘導的細胞自噬限制結核分枝桿菌方面至關重要[32]。IRGM介導自噬的機制尚不清楚，但最近來自Deretic團隊的一項研究顯示線粒體在這個過程中發揮重要作用。IRGM聚集于線粒體并調節線粒體分裂，這一機制在自噬泡調控細胞內病原過程中發揮作用[33]。IRGM對線粒體的定位取決于IRGM與心磷脂的相互作用，心磷脂是主要在線粒體內膜中發現的一種線粒體脂質。另外，對IRGMmRNA剪接突變體的研究結果表明：IRGMd異構體的過表達能誘導線粒體分裂，線粒體去極化和自噬依賴細胞死亡，導致主要的促炎激動劑HMGB1的釋放[33]?？傊?，線粒體的動態調節似乎是決定IRGM在先天免疫中介導自噬（細胞存活）和凋亡或壞死（細胞死亡）這種雙重功能的重要因素。

3線粒體DNA對先天性免疫的調節

有觀點認為線粒體可能是從一種能與宿主細胞共生的古細菌進化而來，因此，線粒體DAMP（mDAMP）可以被認為是介于DAMP和PAMP之間的分子模式。線粒體作為細胞中特殊的細胞器有自身的組成元件，如細胞色素c，甲酰肽和線粒體DNA（mtDNA），在長期的進化過程中，細胞利用這些元件作為mDAMP來防止線粒體損傷。其中細胞色素c從線粒體內膜釋放到細胞質中后能夠與APAF1相互作用，誘導caspase-9依賴的細胞凋亡[34]。mtDNA是另一種重要的mDAMP，在細胞經歷非正常死亡（例如病理學損傷）后釋放并激活一系列先天性免疫通路，最近有報道顯示線粒體中釋放的mtDNA能夠激活TLR9，NLRP3和STING等一些列先天性免疫信號通路[35-37]。在細胞損傷和應激（例如陽離子載體）后從線粒體釋放的mtDNA能夠激活內含體中的TLR9，導致促炎性細胞因子基因的轉錄和促炎細胞因子的釋放，包括MMP-8，TNF-α，IL-6和IL-1β[35,38]。此外，mtDNA在皰疹病毒感染后釋放至細胞質中，被cGAS-cGAMP-STING通路識別，導致TBK1-IRF3依賴的I型IFN通路激活并抑制病毒復制[37,39]。另外，有趣的是，登革熱病毒作為一種RNA病毒，同樣能夠誘導mtDNA的釋放和cGAS-cGAMP-STING通路的激活，說明RNA病毒似乎也能間接激活DNA受體cGAS介導的信號通路[40]。另一篇與之結果相反的報道顯示：登革熱病毒的NS2B蛋白能夠靶向降解cGAS，抑制mtDNA介導的cGAS通路的激活[41]。這些結果說明RNA病毒通過誘導mtDNA釋放激活cGAS通路還有待進一步證實。此外，諸如ATP的刺激能夠誘導線粒體功能障礙，mtDNA釋放到細胞質中結合并激活NLRP3炎性小體，NLRP3炎癥小體募集和激活caspase-1，其將IL-1β和IL-18前體切割成其生物活性形式。另一方面，微管相關蛋白1輕鏈3B（LC3B）/Beclin1介導的細胞自噬參與了mtDNA的清除，從而負調控NLRP3炎性小體的活化[36,42]。

4展望

越來越多的證據表明：線粒體除了在細胞代謝過程和細胞死亡中發揮重要作用，它還是先天免疫信號激活的關鍵平臺。目前還有很多問題尚待解決：為什么細胞中有眾多細胞器，唯獨線粒體與先天性免疫關系如此密切？其中一種可能性是線粒體上多種先天免疫途徑分子的存在。另一個可能的原因就是線粒體是細胞內ROS的主要來源，其在許多方面有助于宿主防御病原體。另外，為何mtDNA，而不是基因組DNA能夠被宿主cGAS通路識別，cGAS通路是如何分辨mtDNA和基因組DNA的？目前針對病毒的防控主要停留在分子水平，通過對線粒體與抗病毒先天性免疫的研究，能夠為我們從細胞器水平進行病毒防控提供新策略。

作者：毛旭明1；孫英杰2；武瑋2；謝軍3；丁鏟2；吳艷濤1 單位：1.揚州大學獸醫學院，2..中國農業科學院上海獸醫研究所，3.西北民族大學生命科學與工程學院