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摘要:目的探討跨膜蛋白16f（TMEM16F）在乳腺癌細胞中的表達，闡明敲除TMEM16F對T47D乳腺癌細胞增殖和遷移的影響。方法應用Westernblotting檢測MDA-MB-231、T47D乳腺癌細胞TMEM16F蛋白表達。應用CCK-8細胞增殖實驗檢測敲除TMEM16F對T47D乳腺癌細胞增殖的影響。應用細胞劃痕實驗檢測敲除TMEM16F對T47D乳腺癌細胞遷移的影響。結果West-ernblotting結果顯示，在乳腺癌細胞中有TMEM16F蛋白表達。CCK-8細胞增殖實驗結果顯示，與ScrambledshRNA組比較，敲除TMEM16F后T47D乳腺癌細胞增殖能力降低（P=0.0370）。劃痕實驗結果顯示，與對照組比較，敲除TMEM16F后T47D乳腺癌細胞的遷移能力增強（P=0.0027）。結論TMEM16F在T47D乳腺癌細胞中高表達，敲除TMEM16F能夠抑制T47D乳腺癌細胞增殖而促進T47D乳腺癌細胞遷移。

關鍵詞:乳腺癌；跨膜蛋白16F；增殖；遷移

跨膜蛋白16F（transmembraneprotein16F，TMEM16F）又稱作Anoctamin（ANO）6，是TMEM16家族的成員之一［1］，是1個具有10次跨膜結構的蛋白。它在人類許多組織（胃上皮細胞、成骨細胞、淋巴細胞、血小板細胞、脈管系統以及腎臟）中都有表達［2］，與多種疾病的發生發展密切相關。TMEM16F結構還不明確，目前主要有3種說法：（1）TMEM16F具有磷脂翻轉功能，這與其他TMEM16家族成員不同［3-4］，在細胞膜上存在磷脂分布不對稱性，外小葉上富含鞘磷脂和磷脂酰膽堿，內部小葉上含有磷酯酰絲氨酸和磷脂酰乙醇胺，這種磷脂不對稱分布由一種依賴ATP的蛋白（scramblease）維持。無論在生理還是病理條件下Ca2+依賴的scramblease激活通過催化使磷酯酰絲氨酸快速外翻到細胞表面，而使這種膜不對稱性崩塌［5］。（2）研究［6-7］發現，TMEM16F作為一種Ca2+激活的非選擇性陽離子通道在血凝固期間能夠對血小板造成磷脂翻轉。（3）有研究［8］認為TMEM16F是Ca2+激活的陰離子通道。2009年，研究［9］發現TMEM16家族中的很多成員都在腫瘤中過表達。研究［10］也發現TMEM16家族中的TMEM16A、TMEM16F、TMEM16K通常在同一組織中表達，并且TMEM16A基因定位于人類染色體11q13區域（ampliconcore），此區域很多基因在乳腺癌、肺癌中高表達，且在癌癥發生發展過程中都有重要作用［11］。2013年，有研究［12］表明在TMEM16F和TMEM16A穩定敲除的ELA細胞中，細胞遷移速率下降，并且TMEM16F會促進成肌細胞C2C12增殖［13-14］。TMEM16F與TMEM16A同源，TMEM16F與乳腺癌的相關性及對乳腺癌細胞遷移和增殖的影響還需進一步研究。本研究擬探討TMEM16F在乳腺癌細胞中的表達，瞬時轉染靶向TMEM16F的特異性shRNA到乳腺癌細胞T47D中，檢測TMEM16F對乳腺癌細胞增殖和遷移的影響。

1材料與方法

1.1細胞培養

乳腺癌MDA-MB-231、T47D細胞（均來自美國菌種保藏中心）于5%CO2、37℃的恒溫箱內，在含10％胎牛血清（以色列BiologicalIndustries公司）和1％青霉素和鏈霉素的DMEM胎牛血清培養液中培養。

1.2轉染

鼠源TMEM16F的smallhairpinRNA（shRNA，上海吉凱基因公司），序列為ATGTACTCACGTAGTGATA，用scrambledshRNA（TTCTCCGAACGTGTCACGT）作為陰性對照。采用Lipofectamin2000（美國Invitro-gen公司）在無血清的培養基中瞬時轉染T47D細胞的靶向TMEM16F特異性shRNA。轉染48h后將細胞用于后續實驗。1.3Westernblotting檢測細胞轉染48h后將T47D細胞在含有RIPA緩沖液和蛋白酶抑制劑混合物（中國Beyotime公司）的冰冷裂解緩沖液中勻漿。在含有蛋白酶抑制劑和PMSF（細胞裂解緩沖液試劑盒，中國BeyotimeBio-technology公司）的冰冷RIPA緩沖液中，將細胞裂解物以13400r/min離心15min，使用BCA方法測定蛋白質濃度。通過SDS-PAGE分離蛋白質，通過濕轉膜方法轉移到PVDF膜上。用5％的脫脂奶粉封閉，然后用TMEM16F抗體（1∶1000，美國Thermo公司）4℃下過夜孵育。用β-actin作為內參對照，然后將PVDF膜用與辣根過氧化物酶結合的山羊抗兔二抗（1∶10000，美國Abcam公司）室溫下孵育1h。使用顯色增強的化學發光檢測液ECL（美國BIO-RAD公司）進行顯影。

1.4CCK-8實驗

通過CCK-8試劑盒（中國Biosharp公司）檢測細胞活力。將轉染48h后的T47D細胞（2×103/孔）接種到96孔板中。細胞在培養基中生長24h后與CCK-8溶液一起溫育2h。采用酶標儀（美國MolecularDevices公司）450nm波長測量。

1.5細胞劃痕實驗

細胞轉染48h后將細胞（1×106/孔）接種在6孔板中。用200μL移液管尖端輕輕刮擦匯合細胞，然后PBS輕輕洗滌。使用光學顯微鏡在0、24h分別獲得圖像，并記錄劃痕面積。

1.6統計學分析

應用GraphPadPrism62.02軟件進行統計學分析，計量資料以x-±s表示，2組比較采用t檢驗。每組實驗重復3次，P<0.05為差異有統計學意義。

2結果

2.1乳腺癌細胞中TMEM16F蛋白表達

結果顯示，TMEM16F在乳腺癌細胞T47D及MDA-MB-231中均有表達，在乳腺癌細胞T47D表達水平高于乳腺癌細胞MDA-MB-231?？梢奣MEM16F與乳腺癌密切相關，見圖1。2.22組乳腺癌細胞T47D中TMEM16F蛋白表達比較相對于轉染TMEM16FscrambledshRNA組（1.00±0.00），靶向TMEM16F的特異性shRNA組（0.42±0.12） 對TMEM16F表達有明顯抑制作用，2組比較差異有統計學意義（t=6.072，P=0.0261）。

2.3敲除T47D乳腺癌細胞TMEM16F后對細胞增殖能力的影響

結果顯示，特異性靶向TMEM16F的shRNA體外轉染乳腺癌細胞T47D，敲除TMEM16F后T47D細胞增殖能力減弱。與對照組（scrambledshRNA組，1.00±0.00）比較，敲除T47D細胞中TMEM16F后細胞增殖（0.50±0.14）差異有統計學意義（t=5.055，P=0.0370）。

2.4敲除T47D乳腺癌細胞TMEM16F后對細胞遷移能力的影響

結果顯示，轉染TMEM16FshRNA后，T47D細胞的遷移能力增強，見圖3。與對照組［scrambledshRNA組，（31.45±0.94）%］比較，敲除T47D細胞中TMEM16F后的細胞遷移率［（46.74±0.42）%］增高，差異有統計學意義（t=19.17，P=0.0027）。

3討論

研究［1］表明TMEM16家族參與多種生理功能（離子運輸、磷脂翻轉以及其他膜蛋白監管等）。YU等［10］發現TMEM16家族中TMEM16F與TMEM16A密不可分，TMEM16F具有scramblease活性，而TMEM16A沒有。并且通過TMEM16A與TMEM16F結合的雜交蛋白確定了TMEM16F區域負責scramblease活性。除此之外，scramblease區域電腦模型顯示出它能夠向細胞膜表面形成1個凹槽來幫助磷脂穿梭于細胞膜的雙分子層，最終這個凹槽能夠與其他的蛋白相互作用來調節磷脂翻轉［10］。2013年研究［12］發現ELA細胞中穩定敲除TMEM16F和TMEM16A后細胞的遷移速率下降。但是TMEM16A和TMEM16F在細胞遷移過程中扮演不同角色，進而影響細胞遷移機制中的不同組分，TMEM16A更傾向于轉向過程，TMEM16F更類似于遷移過程中的“引擎”，影響遷移速率［12］。研究［13-15］表明TMEM16A能夠促進癌細胞增殖，TME-M16A在乳腺癌細胞中能夠通過ERK/AKT信號通路促進乳腺癌細胞增殖。2014年ZHAO等［16］研究發現TMEM16F也可以通過ERK/AKT通路相似地調節C2C12細胞，促進成肌細胞增殖。本研究結果證實，無論是三陰性乳腺癌細胞（MDA-MB-231），還是PR、ER陽性乳腺癌細胞（T47D）中，TMEM16F均表達，說明乳腺癌細胞與TMEM16F相關。CCK-8實驗結果發現TMEM16F敲除后T47D細胞生存能力降低，證實TMEM16F可能促進T47D乳腺癌細胞增殖。細胞劃痕實驗發現TMEM16F敲除后的T47D細胞遷移率增加，證實TMEM16F可能會抑制T47D乳腺癌細胞的遷移。綜上所述，TMEM16F在T47D乳腺癌細胞中高表達，敲除TMEM16F能夠抑制T47D乳腺癌細胞增殖而促進T47D乳腺癌細胞遷移。但TMEM16F在乳腺癌細胞增殖、遷移過程中具體作用機制需進一步研究。乳腺癌患者治療通常采用全身、局部或者綜合治療［17］。雖然通過活檢或者常規影像學和放射學檢查可以獲得相應的疾病進展狀況，但在沒有相應標志物的情況下可能導致治療無效，因此尋找到新的靶向標志物至關重要。本研究提示TMEM16F可能成為乳腺癌細胞治療的新的靶向標志物。

作者：樊璐 王慧 肖慶桓 單位：中國醫科大學藥學院離子通道藥理學研究室