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［摘要］目的制備紅芪多糖HG－2及建立紅芪多糖HG－2的含量測定方法，并聯合透明質酸水凝膠測定凝膠時間、釋藥量、降解及溶脹率等參數。方法采用SephadexG－25純化制備紅芪多糖HG－2，苯酚－硫酸法測定含量，并用化學改性法制備透明質酸（HA）水凝膠，將二者聯合制備紅芪多糖HG－2HA水凝膠。結果紅芪多糖HG－2的含量為95．97％，HA水凝膠的凝膠時間為（180±20）s；溶脹率為42．33％；并在第5天基本降解。紅芪多糖HG－2HA水凝膠釋藥在第120h已趨于平穩，釋藥量為86．15％。結論選用葡萄糖作為對照品測定紅芪多糖HG－2含量的方法簡便、準確。紅芪多糖HG－2HA水凝膠能夠起到緩釋作用，二者聯用具有可行性，可以為后續動物實驗提供理論依據。

［關鍵詞］紅芪多糖；SephadexG－25；苯酚－硫酸法；透明質酸水凝膠；釋藥

紅芪（HedysariRadix）為豆科巖黃芪屬植物多序巖黃芪（HedysarumpolybotrysHand．－Mazz．）的干燥根。具有固表止汗，補氣利尿，托毒斂瘡等功效［1］。常用于治療氣虛、多汗、慢性腎炎及心臟病等［2］疾病，效果顯著。其中紅芪多糖作為紅芪藥材的主要活性成分，具有抗自由基和抗腫瘤、調節免疫等多種藥理作用［3－5］，由5種單糖組成［6－8］。水凝膠為三維網狀結構膠體［9］，具有良好的生物相容性［10］，常應用于組織工程材料、藥物緩釋載體、角膜接觸鏡材料等［11］，因其獨特的性質，日益為科研研究及臨床應用所重視。透明質酸（Hyaluronicacid，HA）屬酸性黏多糖，首次發現是從牛眼玻璃體中分離得到［12］，并具有改善皮膚代謝、保濕及促進透皮吸收的作用。HA水凝膠是HA與相應交聯劑交聯制成，其療效明顯延長［13］，在治療骨關節炎、細胞增殖等方面有廣泛應用與研究。該課題前期研究發現紅芪多糖對骨關節炎有一定的治療作用，并且相關研究顯示HA水凝膠對骨關節炎有一定的治療作用，且具有緩釋藥物的作用。因此本試驗分離純化紅芪多糖HG－2并將其包封于HA水凝膠中，考察其凝膠時間、溶脹率、釋藥量以及酶降解速率等參數，并綜合以上相關參數分析其可行性，為后續大鼠骨關節炎的治療作用提供理論依據。

1材料

1．1儀器

UV－3300型紫外可見分光光度計（上海美普達儀器有限公司），KERN－ABJ型電子分析天平（上海實驗器材有限公司），YLA－2000型真空干燥箱（龍口市先科儀器公司），3K15型低溫高速離心機（SIGMA公司），冷凍干燥機（北京博醫康實驗儀器有限公司）。

1．2試藥

紅芪〔購自甘肅省隴西縣首陽鎮，經甘肅中醫藥大學楊扶德教授鑒定為豆科巖黃芪屬植物多序巖黃芪（HedysarumpolybotrysHand．－Mazz．）的干燥根〕。木糖、葡萄糖、半乳糖、阿拉伯糖、鼠李糖對照品（均來自上海源葉生物科技有限公司，批號分別為B21880、B21882、B21893、B21891、BB21931）。過硫酸銨（0．1mol•L－1）、四甲基乙二胺（0．1mol•L－1）（西安義信化工有限公司），其余試劑均為分析純。

2紅芪多糖HG－2的制備及含量測定

2．1紅芪多糖的提取

稱取500．0g干燥紅芪藥材，浸泡30min后10倍量水煎煮2次（分別為2h，1h），趁熱抽濾提取液并濃縮至一定體積，冷卻至室溫，濃縮液中加入無水乙醇使其含醇量達到60％，放置24h后抽濾，取沉淀用熱水溶解，離心濾過，所得濾液再次醇沉至含醇量達80％，室溫靜置24h。抽濾，沉淀物依次用無水乙醇、丙酮洗滌，待沉淀呈類白色時放入55℃烘箱中烘干即得紅芪多糖。

2．2精制紅芪多糖

取2．1項下紅芪多糖粉末5．0g，溶解并定容至25ml量瓶中，采用水提醇沉使乙醇濃度達到80％，連續沉淀2次，然后抽濾，沉淀物再用無水乙醇、丙酮洗滌至無色，使其在55℃烘箱中烘干，即得精制紅芪多糖。

2．3紅芪多糖的純化（脫蛋白）

取紅芪多糖10．0g溶解并定容至100ml量瓶中，采用Sevage法，加入同體積的正丁醇－氯仿（1∶4），振蕩30min，靜置分層，離心除去沉淀，上清液重復操作，直到無明顯沉淀，合并上清液后醇沉。沉淀物依次用無水乙醇，丙酮洗滌至無色時，于55℃烘箱中恒溫干燥12h，即得脫蛋白紅芪多糖。

2．4紅芪多糖HG－2的制備

取25．0gSephadexG－25凝膠充分溶脹后裝柱。稱取脫蛋白紅芪多糖2．0g，溶解并定容至50ml量瓶中，微孔濾膜濾過后進樣。洗脫劑為蒸餾水，流速：0．8ml•min－1。接樣，每3ml為1個樣，苯酚－硫酸法跟蹤檢測，測定吸光度（A）值，并繪制洗脫曲線，見圖1。合并主峰流出液，濃縮至一定體積，醇沉至醇濃度為80％，靜置24h，抽濾，沉淀物用丙酮脫色，放置55℃恒溫干燥箱中12h，即得紅芪多糖HG－2。

2．5試驗條件的選擇

2．5．1最大吸收波長根據紫外分光光譜顯示的吸收波長，可得最大吸收波長為490nm。2．5．2對照品取相同濃度的葡萄糖、阿拉伯糖、半乳糖、木糖、鼠李糖和紅芪多糖HG－2溶液各2．0ml于具塞試管中，共9組。精密移取5％的苯酚溶液1．0ml至具塞試管中，搖勻，迅速滴加濃硫酸5．0ml，分別將其置于0、60、65、70、75、80、85、90、95℃水浴中恒溫15min，然后再冷卻至室溫，分別在490nm處測定A值，雙蒸水空白調零，結果見圖2。由圖2可知（未將0℃A值計入圖2，表1中說明k值變化），不同溫度下各糖的A值均有所變化。根據圖2曲線，將其按照溫度分為0～60、60～65、65～70、70～75、75～80、80～85、85～90、90～95共8個梯度，計算各部分曲線的斜率k值，見表1。從表1中可以得出，在75～80℃梯度內葡萄糖與紅芪多糖HG－2其k值最接近，說明二者在此溫度范圍內變化趨勢一致，線性關系較好，且二者75℃下A值均高于80℃的A值，因此在苯酚－硫酸法測定紅芪多糖HG－2的含量時，選擇葡萄糖為對照品，后續水浴溫度均選擇75℃。

2．6紅芪多糖HG－2的含量測定

2．6．1葡萄糖標準曲線的繪制精密稱取葡萄糖對照品2．5mg，蒸餾水定容至25ml量瓶中，使其濃度為0．1mg•ml－1的葡萄糖貯備液。精密移取上述貯備液0．2、0．4、0．6、0．8、1．0、1．2、1．4ml于10ml具塞試管中，適量補水至體積為2ml。苯酚－濃硫酸法處理樣品，75℃水浴15min，再冷卻至室溫，以同樣處理的雙蒸水為空白進行比色，在490nm處分別測定對照品的A值。以A值為縱坐標，以對應的葡萄糖濃度（mg•ml－1）為橫坐標繪制標準曲線，得到的標準曲線為：Y＝12．254X＋0．0077，r＝0．9982說明多糖濃度在0～0．1mg•ml－1范圍內，與A值呈良好的線性關系。2．6．2換算因子精密稱取2．2項下精制HPS10．0mg，蒸餾水溶解并定容至25ml量瓶中。精密吸取該溶液0．2ml于具塞試管中，補水至2．0ml，根據上述條件測定A值，并按照以下公式計算換算因子f。f＝W／CD以上計算公式中W為稱取的精制HPS的質量（mg）；C為多糖溶液中葡萄糖的濃度（mg•ml－1）；D為多糖的稀釋倍數，計算得f＝2．4。2．6．3含量測定精密稱取紅芪多糖HG－210．0mg，定容至25ml量瓶中。取0．2ml該溶液于10ml具塞試管中，補水至2．0ml，按上述條件測A值并計算。含量（％）＝CDf／W×100％，C為HG－2的濃度（mg•ml－1），D為HG－2的稀釋倍數，W為稱取的HG－2的質量（mg）。計算得紅芪多糖HG－2的含量為95．97％。3紅芪多糖HG－2HA水凝膠的參數測定

3．1HA水凝膠的制備

精密稱取1．0g透明質酸鈉（分子量8萬～19萬），100ml去離子水充分溶解；加1ml甲基丙烯酸酐，用2mol•L－1的氫氧化鈉調pH值并保持pH值在8．0～8．5，反應12h。以上操作全部冰浴進行。然后放入冰箱攪拌12h。將上述反應后的溶液裝于透析袋并置于水中，3d氯化鈉溶液（0．1mol•L－1），3d超純水，每天換水4次。透析結束后裝入50ml離心管，冷凍干燥即得MeHA（甲基丙烯酸酯化的透明質酸）。精密稱取2．0mgMeHA置于1．5ml離心管中，加入160μl蒸餾水充分溶解，加入20μl過硫酸銨貯備液，混勻，再加入20μl四甲基乙二胺貯備液，迅速混勻，凝膠后即得HA水凝膠。

3．2紅芪多糖HG－2HA水凝膠的制備

稱取52．5mg紅芪多糖HG－2，定容至50ml量瓶（1．05mg•ml－1）。精密稱取2mgMeHA置于1．5ml離心管中，加入160μl紅芪多糖HG－2溶液充分溶解，加入20μl過硫酸銨貯備液，混勻，再加入20μl四甲基乙二胺貯備液，迅速混勻，凝膠后即得紅芪多糖HG－2HA水凝膠。

3．3紅芪多糖HG－2HA水凝膠相關參數的測定

3．3．1凝膠時間（1）按3．2項下制備紅芪多糖HG－2HA水凝膠，迅速混勻后置于37℃水浴并開始計時。（2）間歇性的取出離心管翻轉，觀察液體是否流動。（3）離心管倒立，輕扣管壁，若其中液體不再往下流時，說明凝膠已經形成，記錄凝膠時間。結果表明：凝膠時間為（180±20）s。3．3．2溶脹率（1）待水凝膠凝固成膠體后，稱質量為M0。（2）將凝膠保持在37℃恒溫PBS水浴溶液中，放置過夜，使其自然溶脹。（3）從PBS中取出水凝膠，用濾紙吸去表面溶液，并再次稱質量為M1。（4）溶脹率由公式計算得出：溶脹率（％）＝（M1－M0）／M0×100％。結果表明：水凝膠溶脹率為42．33％。3．3．3紅芪多糖HG－2HA水凝膠的釋藥制備紅芪多糖HG－2水凝膠浸泡在4．0mlPBS中，并置于37℃恒溫培養搖床中，振蕩速率為50r•min－1。在預先選定的時間點（6、24、48、72、120和144h），取出1ml溶液，使用紫外－可見分光光度計檢測其在490nm處的吸收強度，通過標準曲線計算溶液中紅芪多糖的濃度，繪制曲線。每次取樣后，溶液中都加入1ml新配的PBS，以維持總體積恒定。取3個平行樣進行測試，數據表示為平均值。釋藥曲線見圖3。由圖3可知，隨著時間的增加，紅芪多糖HG－2的釋放量也在不斷增加，第5天紅芪多糖HG－2的釋藥量達到86．15％，說明水凝膠對藥物起到了緩釋作用。3．3．4水凝膠體外酶降解速率測定（1）通過計算水凝膠在酶作用下質量的變化而得。（2）根據水凝膠的化學成分，配制濃度為6μg•ml－1的透明質酸酶（體液中透明質酸酶的濃度約為60ng•ml－1，擴大100倍）。（3）先讓水凝膠在PBS溶液中自然溶脹，然后取出稱質量得m0。（4）將水凝膠置于37℃透明質酸酶工作液中，每天換1次溶液。（5）根據需要，控制降解時間，1、3、5d，取出凝膠，稱質量得m1（m1，多次稱質量直到恒定／變化很小）。（6）降解速率通過公式計算得出：質量損失（％）＝（m0－m1）／m0×100％。水凝膠降解速率如圖

4.結果表明：

透明質酸水凝膠在第5天已基本降解完全。4討論本試驗采用傳統的水提醇沉法得到紅芪多糖，并通過脫蛋白、過葡聚糖凝膠柱等方法分離純化得到紅芪多糖HG－2，含量明顯提高。在紅芪多糖HG－2的制備過程中，樣品預處理、柱高、洗脫流速、洗脫劑均為影響因素；如樣品用微孔濾膜過濾，凝膠柱一般選擇柱高與直徑比為20∶1的層析柱，洗脫劑選純水等。本試驗對紅芪多糖HG－2的含量測定方法進行研究，選用葡萄糖作對照品，測定其含量的方法簡便、可靠。本試驗進一步完善了以葡萄糖為對照計算多糖含量，提高了試驗的準確性，本試驗考察了紅芪多糖HG－2與透明質酸水凝膠結合的相關參數，為二者聯用提供了理論依據，亦為后續紅芪多糖的開發利用奠定基礎。

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作者：張䶮 周尚儒 燕玉奎 郭玫 單位：甘肅中醫藥大學藥學院