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［摘要］目的研究辣椒素對大鼠肝缺血再灌注損傷的影響，并初步探討保護作用的潛在機制。方法將30只健康雄性SD大鼠隨機均分為空白對照組、模型組、辣椒素組，用無創血管夾夾閉大鼠左、中葉肝蒂建立70％肝臟缺血再灌注損傷模型。ELISA法檢測血清中谷丙轉氨酶（ALT）、谷草轉氨酶（AST）和乳酸脫氫酶（LDH）水平；HE染色檢測肝臟病理形態；蛋白免疫印跡法檢測肝臟BCL－2、Bax、BCL－XL、激活性Caspase3（C－Caspase3）、ERK和p－ERK水平；TUNEL檢測肝臟細胞凋亡。結果與空白對照組相比，模型組ALT、AST、LDH、Bax、C－Caspase3、p－ERK和TUNEL水平明顯增高，而BCL－2和BCL－XL降低，肝組織病理改變明顯增加，ERK水平無差異；與模型組相比，辣椒素組ALT、AST、LDH、Bax、C－Caspase3、p－ERK和TUNEL水平明顯降低，而BCL－2和BCL－XL表達增高，肝組織病理改變明顯減少。結論辣椒素對肝臟缺血再灌注損傷有保護作用，其作用機制可能與抑制ERK磷酸化，減輕細胞凋亡相關。

［關鍵詞］辣椒素；肝臟缺血再灌注損傷；細胞凋亡；大鼠

肝臟缺血再灌注損傷（ischemiareperfusionin－jury，IRI）常出現在心臟體外大循環、肝葉切除、肝移植等手術過程中，是導致肝功受損，乃至肝功衰竭的重要病因。減輕肝臟IRI目前是臨床研究的難點和熱點［1，2］。在肝臟IRI中，涉及多條信號途徑和多種細胞因子。有研究顯示MAPKs信號途徑在肝臟IRI被活化激活，ERK信號途徑系MAPKs家族的重要成員之一，可被缺血，感染等有害刺激通過磷酸化途徑激活，進而引發細胞凋亡和壞死等［3］。目前有實驗顯示抑制ERK信號途徑激活可減輕IRI。辣椒素是從辣椒萃取的主要單體，是瞬時感受器電位香草酸受體－1（Transientreceptorpotentialvanilloid－1，TRPV1）的激動劑，具有防治心腦血管疾病，調節免疫，對肺和心臟IRI具有保護作用［4－6］，但對肝臟IRI研究較少，其作用途徑是否與ERK－MAPK信號途徑相關尚需進一步探索。本研究擬探討辣椒素對肝臟IRI的保護作用及其與ERK－MAPK信號途徑的關系。

1材料與方法

1．1動物

SPF級雄性健康SD大鼠30只，體質量195～245g，購買于四川大學實驗動物中心，動物合格證號：SCXL（川）2014－011。

1．2試藥和儀器

辣椒素（Sigma，USA），TUNEL檢測試劑盒、水合氯醛（均為武漢谷歌），ERK、p－ERK、BCL－2、Bax、BCL－XL、C－Caspase3檢測試劑盒（均為USA，CST）、谷草轉氨酶（AST）、谷丙轉氨酶（ALT）、乳酸脫氫酶（LDH）檢測試劑盒（均為南京建成科技公司），BX51顯微鏡（Olympus）、成像系統（HITMAS公司）。

1．3分組和建模

30只SD大鼠隨機均分為空白對照組、模型組、辣椒素組，每組10只。辣椒素組術前30min給予辣椒素（8μg•kg－1）腹腔注射，劑量參考文獻［7］。空白對照組和模型組術前30min給予等量生理氯化鈉腹腔注射。模型組和辣椒素組參考文獻［8］施予肝臟IRI手術，用無創血管鉗夾閉肝左葉與中葉的血管與膽管造成肝臟70％的缺血，同時保留肝右葉與尾狀葉的血供，阻斷后可見被阻斷區肝葉顏色由鮮紅色變為暗紅色表明肝臟缺血成功，60min后取下無創血管夾恢復肝臟血供。空白對照組操作同上，但不夾閉肝左葉與中葉的血管，無菌手術縫合大鼠腹部切口，敷料包扎。

1．4標本處理

大鼠施予肝臟IRI手術2h后，收集血清和肝臟標本，血清室溫下3000r•min－1離心10min后，收集上清液，部分送仁和醫院檢驗科檢測ALT、AST和LDH水平。1／3肝臟置于多聚甲醛固定，其余肝臟－80℃冰箱凍存。

1．5肝臟病理形態檢測

取肝臟蠟塊4μm切片，脫蠟透明后由病理科實驗室行HE染色，顯微鏡下觀察肝組織的形態學變化并評分。分級評分標準［8］：損傷＜10％，病理評分為0分；損傷10％～25％，病理評分為1分；損傷25％～50％，病理評分為2分；損傷50％～75％，病理評分為3分；損傷75％～100％，病理評分為4分。

1．6蛋白免疫印跡法檢測蛋白水平

取大鼠肝臟50mg置于勻漿器內，加入RIPA和磷酸酶抑制劑，冰上均勻研磨，裂解30min，12000r•min－1離心，取等體積100μl上清液，BCA法測定蛋白濃度，完畢后裂解液稀釋蛋白到等濃度，后5×SDS，水浴煮沸變性10min，置于－80℃冰箱備用。根據蛋白分子量制備不同濃度膠，上樣，電泳80V電壓30min，120V電壓60min。轉膜，封閉2h（脫脂奶粉），TBST洗膜3次，每次5min。脫脂奶粉稀釋液稀釋一抗ERK（1∶500）、p－ERK（1∶1000）、BCL－2（1∶400）、Bax（1∶500）、BCL－XL（1∶500）、C－Caspase3（1∶400）和β－actin（1∶4000），4℃冰箱孵育PVDF膜過夜，TBST洗膜3次，每次5min。孵育脫脂奶粉稀釋配制的HRP標記的二抗IgG（1∶400），37℃振蕩孵育膜1h。TBST洗膜3次，每次5min，化學發光劑顯影，曝光，掃描膠片，ImageG進行圖像分析，計算測定蛋白相對水平（目的蛋白條帶灰度值／內參β－actin條帶灰度值）。

1．7肝細胞凋亡檢測

TUNEL檢測肝細胞凋亡，具體參考說明書方法。

1．8統計學方法

數據采用SPSS13．0軟件進行統計分析，實驗結果采用珚x±s表示，資料采用單因素方差分析（ANOVA），多個樣本之間的兩兩比較采用t檢驗，P＜0．05為差異有統計學意義。

2結果

2．1辣椒素對大鼠血清ALTAST和LDH水平的影響

與空白對照組比較，模型組大鼠血清中ALT、AST和LDH水平明顯增高（P＜0．05）。與模型組比較，辣椒素組大鼠血清中ALT、AST和LDH水平均明顯降低（P＜0．05）。提示辣椒素對肝臟IRI具有一定保護作用，見表1。

2．2辣椒素對大鼠肝組織病理結構的影響

空白對照組肝臟形態結構完整，未見肝細胞壞死，炎癥細胞浸潤。肝臟IRI模型組可見肝細胞廣泛腫脹，變性壞死，肝血竇區和中央靜脈廣泛淤血腫脹，門管區炎性細胞明顯浸潤，肝小葉結構明顯破壞。辣椒素組偶見部分肝細胞腫脹，壞死，未見片狀壞死，少量肝細胞氣球樣變和門管區散在炎性細胞浸潤，與空白對照組相比，辣椒素組肝臟病理形態改變無明顯差異，見圖1，提示辣椒素可減輕肝臟病理結構改變。圖1辣椒素對IRI大鼠肝組織病理結構的影響（HE，×200）

2．3辣椒素對大鼠肝臟BCL－2BCL－XLBax和C－Caspase3水平影響

檢測結果顯示與空白對照組相比，模型組大鼠肝臟Bax和C－Caspase3蛋白水平明顯增高（P＜0．05），而BCL－2和BCL－XL蛋白水平明顯降低（P＜0．05）；與模型組相比，辣椒素組大鼠肝臟Bax和C－Caspase3蛋白水平明顯降低（P＜0．05），而BCL－2和BCL－XL蛋白水平明顯增高（P＜0．05）。提示辣椒素可抑制凋亡信號通路激活，見圖2。

2．4辣椒素對大鼠肝組織ERK和p－ERK蛋白水平影響

檢測結果顯示，與空白對照組相比，模型組大鼠肝組織p－ERK蛋白水平明顯增高（P＜0．05），而ERK表達無差異（P＞0．05）；與模型組組相比，辣椒素組大鼠肝組織p－ERK蛋白水平明顯降低（P＜0．05），而ERK表達無差異（P＞0．05）。辣椒素組與空白對照組相比無顯著性差異（P＞0．05）。提示辣椒素可以抑制ERK信號通路激活，見圖3。圖3辣椒素對IRI大鼠肝組織p－ERK和ERK蛋白水平影響

2．5辣椒素對大鼠肝細胞凋亡的影響

檢測結果顯示，與空白對照組相比，模型組肝細胞TUNEL表達明顯增加（P＜0．05）；與模型組相比，辣椒素組肝細胞TUNEL表達明顯降低（P＜0．05）；提示辣椒素可明顯降低肝臟細胞凋亡，見圖4。

3討論

肝臟IRI是臨床上常見的病理生理過程，好發于肝移植、肝切除和心臟體外循環手術等過程中，其發病常不可避免，嚴重影響手術的療效和患者的預后［1，2］。因此減輕肝臟IRI具有重要的臨床應用價值．既往研究顯示肝臟IRI的發病機制十分復雜，是一個錯綜復雜的過程。涉及炎癥反應、微循環障礙、鈣超載、自由基清除受阻、間質水腫、細胞凋亡和壞死等［9，10］。本實驗研究發現，肝臟IRI后，血清中肝臟損傷標記物（ALT、AST和LDH）水平明顯增加，肝臟病理損傷明顯加重，細胞凋亡標志物TUNEL明顯上調，這與既往研究結果相一致，提示肝臟IRI引發的肝臟細胞凋亡是導致肝臟受損的重要通路。因此，阻斷或減少肝臟細胞凋亡是防治肝臟IRI的重要途徑。既往研究顯示，在肝臟IRI過程中，肝臟細胞凋亡受凋亡相關的基因和蛋白嚴密調控，與細胞凋亡相關的基因大多可分為促凋亡的基因和抗凋亡的基因［9］。BCL－2和BCL－XL是細胞內一對極其重要的抗凋亡基因，而Bax和Bad為Bcl－2家族的成員，其作用與抗凋亡基因BCL－2和BCL－XL完全相反，具有促進細胞凋亡的作用［11］。有研究顯示BCL－2和BCL－XL的表達增高以及Bcl－2／Bax，Bcl－2／Bad，Bcl－xl／Bax，Bcl－xl／Bad比值增加可抑制Bax和Bad的活化，從而減輕細胞凋亡［11］。本實驗結果證實，應用辣椒素預處理能明顯減少血清中肝臟損傷標記物（ALT、AST和LDH）水平和肝臟病理改變，下調TUNEL的表達，增加Bcl－2蛋白水平，減少Bax和Bad蛋白水平，并使Bcl－2／Bax，Bcl－2／Bad，Bcl－xl／Bax，Bcl－xl／Bad比值增加。提示辣椒素能減少IRI引發肝臟細胞的凋亡，且辣椒素的肝臟保護作用與抑制Bcl－2／Bad，Bcl－2／Bax，Bcl－xl／Bax和Bcl－xl／Bad介導的肝臟細胞凋亡密切相關。近來研究發現在肝臟IRI過程中，凋亡相關基因和蛋白的表達、調控與MAPK信號轉導途徑密切相關［12］。而ERK是MAPK激活途徑中極重要的一類［13］。抑制ERK信號途徑可減輕肝IRI［13］。本研究結果顯示，肝臟IRI組p－ERK表達明顯增高，進一步證實了IRI傷刺激可促進ERK信號途徑磷酸化激活。而辣椒素預處理，可明顯降低ERK的磷酸化水平。結果提示辣椒素可能通過抑制ERK磷酸化促進抗凋亡蛋白BCL－2的表達，而減少促凋亡蛋白Bax和Bax等的表達。綜上所述，辣椒素可能通過抗凋亡信號途徑減輕肝臟IRI，其作用途徑與抑制ERK磷酸化，促進Bcl－27Bad，Bcl－2／Bax，Bcl－xl／Bax和Bcl－xl／Bad比值增加相關。

［參考文獻］

［7］秦素蘭，劉陜嶺，王儒蓉．辣椒素對大鼠心肌缺血再灌注損傷保護作用的研究［J］．四川大學學報（醫學版），2008，39（4）：550－554

［8］曹曉飛，張峰，張業偉．PPARγ激動劑羅格列酮在大鼠肝缺血再灌注損傷中的作用及機制探討［J］．南京醫科大學學報（自然科學版），2007，27（11）：1271－1273

作者：閆國旗 張凱 宴彩華 王琴 單位：湖北宜昌