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《解放軍醫學雜志》2016年第二期

[摘要]

目的研究斜發沸石(Cp)對亞急性輻射損傷小鼠的防護作用。方法48只雄性BALB/c小鼠隨機分為空白對照組(給予蒸餾水，不照射)、輻照模型組(給予蒸餾水，照射)、300mg/kg523組(照射前24h給予尼爾雌醇200mg/kg，照射后4h給予尼爾雌醇100mg/kg，其余天數給予蒸餾水灌胃，照射)、56mg/kg沸石組(給予56mg/kg沸石水溶液，照射)、167mg/kg沸石組(給予167mg/kg沸石水溶液，照射)和500mg/kg沸石組(給予500mg/kg沸石水溶液，照射)。以灌胃方式連續給藥7d，采用137Csγ射線對小鼠進行一次性全身照射，劑量率為0.75Gy/min，總劑量為4.0Gy。照射后繼續灌胃給藥14d。用血細胞分析儀測定外周血象；測定臟器指數、骨髓DNA含量；檢測小鼠血清超氧化物歧化酶(SOD)活性、丙二醛(MDA)含量及谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-Px)活性；流式細胞儀檢測骨髓造血干細胞含量。結果經137Csγ射線照射后10d，與輻照模型組相比，56mg/kg沸石組與167mg/kg沸石組紅細胞數量明顯升高(P<0.05，P<0.01)，56mg/kg沸石組與500mg/kg沸石組白細胞數量明顯升高(P<0.01)；照射后14d，與輻照模型組相比，沸石各給藥組小鼠血清中SOD活性顯著升高(P<0.05，P<0.01)，167mg/kg沸石組與500mg/kg沸石組GSH-Px活性明顯升高(P<0.01)，56mg/kg沸石組與500mg/kg沸石組骨髓細胞DNA含量明顯升高(P<0.05，P<0.01)，沸石各給藥組骨髓造血干細胞含量明顯升高(P<0.01)。結論斜發沸石對亞急性輻射損傷小鼠具有一定保護作用。

[關鍵詞]

斜發沸石；γ射線；小鼠；輻射防護

斜發沸石屬鋁代硅酸鹽，是一種天然礦石，晶體化學式為(Na,K,Ca)2-3[Al3(Al,Si)2Si13O36]•12H2O[1]，內部有許多大小不一的開放性孔洞和通道，具有很大的比表面積(一般可達300~500m2/g)，因而具有較強的吸附能力和離子交換能力，除可用來吸附廢水中汞、砷、氟、氨氮、苯酚、有機污染物等[2-6]以外，劉愛平等[7]還發現其可用于處理模擬含銫放射性廢水，可見斜發沸石對于放射性元素也具有一定的吸附作用。近年來從天然產物中尋找輻射防護藥物逐漸成為人們關注的熱點[8-9]。本研究觀察斜發沸石對小鼠外周血象、抗氧化指數、臟器指數、骨髓象等指標的影響，為其輻射防護作用的研究提供依據。

1材料與方法

1.1試劑與儀器斜發沸石為北京友合攀寶科技發展有限公司提供。c-kit、Sca-1、Lin–抗體(Biolegend公司，濃度為0.2mg/ml)；超氧化物歧化酶(SOD)、丙二醛(MDA)、谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-PX)試劑盒(南京建成生物工程研究所)；其余化學試劑為國藥集團分析純試劑。MEK-5216型血細胞計數儀(日本NihonKohden公司)；759紫外可見分光光度計(上海奧普樂儀器有限公司)；酶標儀(美國ThermoElectron公司)；流式細胞儀(美國Beckman公司)。

1.2實驗動物與分組BALB/c雄性小鼠48只，體重20±2g，6~8周齡，購自上海思萊克實驗動物有限公司(動物質量合格證號：2008001641038)。137Csγ射線源由復旦大學放射醫學研究所提供。48只雄性BALB/c小鼠隨機分為空白對照組(給予蒸餾水，不照射)、輻照模型組(給予蒸餾水，照射)、300mg/kg523組(照射前24h給予尼爾雌醇200mg/kg，照射后4h給予尼爾雌醇100mg/kg，其余天數給予蒸餾水灌胃，照射)、56mg/kg沸石組(給予56mg/kg沸石水溶液，照射)、167mg/kg沸石組(給予167mg/kg沸石水溶液，照射)和500mg/kg沸石組(給予500mg/kg沸石水溶液，照射)，每組8只。連續灌胃7d后，除空白對照組外，其余各組小鼠用137Csγ射線進行一次性全身照射，劑量率為0.75Gy/min，總劑量為4.0Gy，照射后繼續灌胃給藥14d。

1.3小鼠外周血細胞計數小鼠照射后3、10d經尾靜脈取血20µl，照射后14d眼眶靜脈采血20µl，用血細胞分析儀檢測外周血紅細胞(RBC)、白細胞(WBC)和血小板(PLT)數量。

1.4小鼠血清SOD、GSH-Px活性及MDA含量檢測照后14d，取眼眶靜脈血200µl，分離血清。采用試劑盒檢測血清SOD活性，GSH-Px活性和MDA含量。

1.5小鼠臟器指數檢測照后14d，小鼠稱重并處死，取小鼠胸腺、肝臟和脾臟稱重，計算各臟器指數(臟器指數=臟器重量/小鼠體重×100)。

1.6小鼠骨髓DNA含量檢測照后14d，取小鼠左側股骨，用10ml5mmol/LCaCl2溶液沖出骨髓，4℃靜置30min，3000r/min離心10min，沉淀物中加入0.2mol/LHClO4溶液8ml，充分混合，90℃水浴15min；冷卻后3000r/min離心10min，取上清；稀釋3倍后，在260nm處測定吸光度(A)值。

1.7小鼠骨髓造血干細胞含量測定照后14d，取小鼠右側股骨，用0.4ml已滅活的小牛血清沖出骨髓，用細胞流式液稀釋至細胞濃度為1×108/ml，各加入2.5µlc-kit、1.25µlSca-1和10µlLin–抗體，同時各自做陰性對照，4℃避光孵育30min，細胞流式液洗3次，固定后上機行流式細胞儀檢測。

1.8統計學處理采用SPSS17.0軟件進行統計分析。計量資料以x±s表示，兩組間比較采用t檢驗。P<0.05為差異有統計學意義。

2結果

2.1斜發沸石對照射小鼠外周血細胞數量的影響照后3d，與空白對照組相比，輻照模型組小鼠的RBC數量無明顯變化，但WBC和PLT明顯減少(P<0.01，P<0.05)。照后10d，與空白對照組相比，輻照模型組小鼠RBC、WBC和PLT均組明顯減少(P<0.01)；與輻照模型組相比，沸石低劑量組與中劑量組RBC明顯增加(P<0.05，P<0.01)，沸石低劑量組與高劑量組WBC顯著提高(P<0.01)，300mg/mg523組血小板數量明顯增加(P<0.01)。照后14d，輻照模型組小鼠RBC、WBC和PLT均較空白對照組明顯減少(P<0.01)，300mg/mg523組WBC和PLT數量與輻照模型組比較明顯提高(P<0.01，表1)。提示斜發沸石對受輻照小鼠的外周血RBC和WBC具有較好的保護作用，尼爾雌醇對受輻照小鼠的外周血WBC和PLT具有較好的保護作用。

2.2斜發沸石對照射小鼠臟器指數的影響與空白對照組相比，各處理組肝臟指數、脾臟指數與胸腺指數差異無統計學意義(P>0.05)，提示4.0Gy劑量的γ射線輻照后14d未對小鼠臟器指數產生明顯影響。

2.3斜發沸石對照射小鼠血清SOD、GSH-Px活性與MDA含量的影響與空白對照組比較，輻照模型組GSH-Px活性明顯下降(P<0.01)，MDA含量明顯提高(P<0.01)；與輻照模型組相比，沸石各劑量組SOD活性明顯降低，MDA含量明顯升高，沸石中劑量組與高劑量組GSH-Px活性明顯提高(P<0.01，表3)。提示斜發沸石可能通過提高受照射小鼠GSH-Px活性對輻射損傷產生保護作用。

2.4斜發沸石對照射小鼠骨髓細胞DNA含量的影響與空白對照組相比，輻照模型組小鼠的骨髓DNA含量明顯下降(P<0.01)；與輻照模型組相比，沸石低劑量組與沸石高劑量組小鼠的骨髓DNA含量均明顯升高(P<0.05，P<0.01，圖1)。提示斜發沸石對骨髓DNA損傷具有一定的保護作用。

2.5斜發沸石對照射小鼠骨髓造血干細胞含量的影響流式細胞儀檢測結果顯示，與空白對照組相比，輻照模型組小鼠的骨髓Lin–細胞含量明顯下降(P<0.01)，由49.83%降至29.98%；與輻照模型組相比，300mg/mg523組與沸石各給藥組小鼠的骨髓Lin–細胞含量均明顯提高(P<0.01)，且骨髓造血干細胞含量隨沸石給藥量的增加而增加，具有一定的劑量依賴(圖2)。提示斜發沸石對受輻照小鼠的骨髓造血系統具有很好的保護作用。

3討論

電離輻射對人體可造成各個系統的嚴重損傷，輻射防護劑主要通過提高動物存活率、拮抗輻射免疫損傷、降低造血系統損害和清除自由基等途徑來實現對動物體的防護作用[10-12]。造血系統是輻照最敏感的系統之一，小鼠接受γ射線全身照射后，外周血RBC、WBC、PLT數量與血紅蛋白含量都會出現明顯下降，骨髓DNA含量、造血干細胞數量也會出現明顯下降趨勢[13]。本研究發現，經4.0Gy劑量的137Csγ射線全身照射后，BALB/c小鼠的外周血WBC和PLT數量在照后第3天即出現顯著下降，表明外周血WBC和PLT對輻照較為敏感，而斜發沸石能夠不同程度地提高受照小鼠外周血WBC的數量。至照射后10d，輻照模型組小鼠外周血RBC數量也明顯下降，沸石各給藥組小鼠外周血RBC數量與輻照模型組相比明顯增加，可見沸石對受輻照小鼠的外周血細胞具有較好的保護作用。

SOD是一種源于生命體的活性物質，能消除生物體在新陳代謝過程中產生的有害物質，而MDA則是機體通過酶系統與非酶系統產生的氧自由基，后者攻擊生物膜中的多不飽和脂肪酸，引發脂質過氧化作用，并形成脂質過氧化物，MDA的含量可反映機體內脂質過氧化程度，間接反映細胞損傷的程度。GSH-Px是機體內廣泛存在的一種重要的催化過氧化氫分解的酶，具有保護細胞膜結構和功能完整的作用[14]。本研究結果顯示，與空白對照組相比，小鼠經照射后體內SOD和GSH-Px活性明顯下降，MDA含量明顯提高，提示照射導致小鼠體內一系列抗氧化酶活性降低，有害過氧化物含量增加；而與輻照模型組相比，沸石給藥組小鼠血清中的GSH-Px活性明顯提高，但SOD活性明顯降低，MDA含量明顯提高，可能因為沸石經γ射線照射后會產生O23-自由基，對機體產生一定的傷害[15]。

蔣定文等[16]研究發現，經5.0Gy60Coγ射線照射后，小鼠脾臟指數與胸腺指數明顯降低。本實驗中小鼠經4.0Gy劑量137Csγ射線照射后，脾臟指數有所降低，但差異無統計學意義，推測可能是照射劑量過低，抑或是照射后14d各臟器損傷已修復所致，其原因尚需進一步實驗驗證。骨髓DNA含量與骨髓造血干細胞含量反映了骨髓有核細胞的數量和骨髓造血系統的增生情況。汪維云[17]與蔣定文等[16]研究發現小鼠經γ射線照射后，骨髓DNA含量明顯降低，表明骨髓造血系統對γ射線照射極為敏感。本實驗結果顯示，經4.0Gyγ射線照射后，小鼠骨髓DNA含量與Lin–細胞含量顯著下降，沸石低劑量組與沸石高劑量組小鼠骨髓DNA含量較輻照模型組明顯提高，但無劑量依賴關系，沸石各給藥組小鼠的骨髓造血干細胞Lin–細胞含量明顯提高，且呈現良好的劑量效應關系。結合沸石對受照射小鼠外周血的保護作用，提示沸石對受照射小鼠的造血系統也具有較好的保護作用，其機制可能是由于沸石可以吸附一定量的放射性元素[18]，排除有害物質，從而實現對機體的輻射防護作用。先前實驗大多圍繞沸石的吸附性能進行研究，本文對斜發沸石的輻射保護效應進行了一系列探究，發現其具有顯著的抗輻射功效，不僅拓寬了沸石的藥用價值，也為輻射防護藥物的開發開辟了新的領域。

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作者：李娜 沈先榮 宗杰 李佳媚 劉瓊 張俊玲 何穎 蔣定文 王慶蓉 單位：上海海洋大學食品學院 海軍醫學研究所輻射防護研究室