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《臨床檢驗雜志》2014年第六期

1對象與方法

1．1TaqMan探針熒光定量PCR分型技術按照TaqMan探針試劑盒(上海天昊公司)說明書操作，檢測CR1基因rs2296160C/T、rs2274567G/A和rs4844600G/A位點多態(tài)性。PCR反應體系為6μL，包括Mastermix3μL，TaqMan探針(40×)0．05μL，模板DNA2μL，滅菌ddH2O補足至6μL。循環(huán)參數(shù):95℃預變性10min;95℃10s，65～55℃15s(每個循環(huán)下降0．5℃)，60℃15s，共20個循環(huán);95℃10s，60℃30s，共25個循環(huán);從60℃開始以0．06℃/s緩慢升溫到61℃，用7500熒光定量PCR儀及自帶軟件(ABI公司)進行熔解曲線分析并判讀野生純合子、突變純合子和雜合子。

1．2DNA測序PCR擴增反應體系為10μL，包括10×PCR緩沖液1．0μL，上、下游引物各1．0μL，模板DNA1．0μL，0．2UTaqDNA聚合酶，用滅菌ddH2O補足至10μL。循環(huán)參數(shù):95℃預變性10min;95℃15s，60℃60s，72℃45s，共40個循環(huán);72℃延伸5min。PCR產物經蝦堿酶(SAP，Promega公司)和外切核酸酶Ⅰ(ExoⅠ，Epicentre公司)純化后用ABI3130測序儀(ABI公司)測序。SNP分型用GeneMapper4．0軟件(AppliedBiosystems公司)進行分析。

1．3統(tǒng)計學分析用SPSS11．5統(tǒng)計軟件進行。基因型和等位基因頻率用直接計數(shù)法計算，各組間基因型及等位基因頻率比較用χ2檢驗，以P＜0．05為有統(tǒng)計學意義。

2結果

2．1CR1基因型檢測結果經TaqMan探針實時熒光PCR檢測，CR1基因rs2296160C/T、rs2274567G/A和rs4844600G/A位點多態(tài)性的SNP分型結果顯示，rs2296160C/T位點檢測到CC、CT和TT3種基因型;rs2274567G/A和rs4844600G/A位點均檢測到GG、GA和AA3種基因型;DNA基因測序進一步證實本實驗結果。見圖1。

2．2CR1基因多態(tài)性在廣西百色地區(qū)壯族健康人群中的分布計算本研究對象中CR1基因型和等位基因頻率，經χ2檢驗，CR1基因rs2296160C/T、rs2274567G/A和rs4844600G/A位點的基因型及等位基因頻率均符合Hardy-Weinberg遺傳平衡(P＞0．05)，說明所選的研究樣本具有群體代表性(表1)。其中rs2296160C/T位點基因型以CC型和CT型最為常見，其等位基因以C型頻率最高，占67．3%;rs2274567G/A位點基因型以GA型多見，其次為AA型和GG型，其等位基因以A型頻率最高，占53．1%;rs4844600G/A位點基因型以GA型多見，占47．9%，其等位基因以G型頻率最高，占61．6%。CR1基因rs2296160C/T、rs2274567G/A和rs4844600G/A3種多態(tài)性基因型頻率在男、女性別間差異無統(tǒng)計學意義(P=0．591、0．293和0．525);而等位基因頻率在男、女間差異亦無統(tǒng)計學意義(P=0．310、0．122和0．268)。表明廣西百色地區(qū)壯族人群中CR1基因rs2296160C/T、rs2274567G/A和rs4844600G/A位點存在多態(tài)性，而這種多態(tài)性的基因型或者等位基因頻率在男、女性別間比較差異無統(tǒng)計學意義(P＞0．05)。見表1。

2．3CR1基因多態(tài)性在不同種族人群間的比較廣西壯族人群CR1基因rs2296160C/T、rs2274567G/A和rs4844600G/A多態(tài)性分布頻率與人類基因組計劃(www．ncbi．nlm．nih．gov/projects/SNP/)公布4個人群(歐洲人、非洲人、日本人和北京人)的SNP分型數(shù)據(jù)進行比較，結果顯示CR1基因rs2296160C/T多態(tài)性的基因型與歐洲人、非洲人、日本人和北京人比較，P分別為0．018、0．000、0．582和0．767，而等位基因的分布頻率在與歐洲人、非洲人、日本人和北京人群比較，P分別為0．015、0．000、0．408和0．475;CR1基因rs2274567G/A多態(tài)性的基因型頻率與歐洲人、非洲人、日本人和北京人群比較，P分別為0．000、0．000、0．264和0．433，而等位基因的分布頻率與歐洲人、非洲人、日本人和北京人群比較，P分別為0．000、0．000、0．323和0．219;CR1基因rs4844600G/A多態(tài)性的基因型頻率與歐洲人、非洲人、日本人和北京人群比較，P分別為0．000、0．000、0．153和0．409，而等位基因的分布頻率與歐洲人、非洲人、日本人和北京人群比較，P分別為0．000、0．000、0．054和0．245。廣西壯族人群CR1基因rs2296160C/T、rs2274567G/A和rs4844600G/A3種多態(tài)性基因型和等位基因的分布頻率與歐洲人和非洲人群比較差異有統(tǒng)計學意義(P＜0．05)，而與日本人、北京人群比較差異無統(tǒng)計學意義(P＞0．05)。見表2、3、4。

3討論

紅細胞CR1是補體受體家族中的重要一員，具有廣泛的生物學功能，包括分子識別、黏附和貯存抗原、抑制補體的激活、清除循環(huán)血中免疫復合物、免疫調理吞噬等多種生物學效應。不同疾病情況下，機體紅細胞CR1數(shù)量及活性存在不同程度的變化，其基因多態(tài)性分布與不同疾病的易感性存在密切相關。CR1基因位于1號染色體長臂上，CR1基因存在多個位點的SNP，這種基因多態(tài)性與瘧疾、阿耳茨海默病、大腦淀粉樣血管病、膽囊癌、冠狀動脈疾病、特發(fā)性肺纖維化、肉狀瘤病等疾病的相關性已成為國內外學者研究的熱點。因此，正確分析和闡明CR1基因多態(tài)性在不同種族和地域人群中的分布特點，能為其在不同人群中與某些疾病發(fā)生、發(fā)展間的關系提供分子遺傳學基礎。

本研究用TaqMan探針熒光定量PCR分型技術和DNA測序法檢測廣西壯族人的CR1基因rs2296160C/T、rs2274567G/A和rs4844600G/A位點多態(tài)性的分布情況，結果顯示，在所觀察的人群中，rs2296160C/T位點表現(xiàn)出CC、CT和TT3種基因型，以CC型(44．9%)最為常見，其等位基因以C(67．3%)最為常見;rs2274567G/A位點也表現(xiàn)出GG、GA和AA3種基因型，以GA型(49．7%)最為常見，其等位基因以A(53．1%)多見;rs4844600G/A位點也表現(xiàn)出GG、GA和AA3種基因型，以GA型(47．7%)最為常見，其等位基因以G(61．6%)多見。以上3種位點基因多態(tài)性的基因型和等位基因頻率在男、女性別間比較均無統(tǒng)計學差異(P＞0．05)。將本研究結果與歐洲、非洲等人群基因多態(tài)性研究結果比較顯示，廣西百色地區(qū)壯族人群中CR1基因rs2296160C/T位點T等位基因頻率為32．7%，顯著高于歐洲人的24．6%(P＜0．05)和非洲人的14．2%(P＜0．05);rs2274567G/A位點A等位基因頻率為53．1%，顯著高于歐洲人的12．8%P＜0．05)和非洲人的23．5%(P＜0．05);rs4844600G/A位點G等位基因頻率為61．6%，顯著低于歐洲人的75．0%(P＜0．05)和非洲人的97．8%(P＜0．05)。本研究結果與日本及北京等亞洲人群比較差異無統(tǒng)計學意義(P＞0．05)。可見CR1基因型分布及等位基因頻率在不同種族間存在著明顯的差異。這一結果符合遺傳學規(guī)律，即親緣關系越近，其基因型分布越相似，反之則差異越顯著。

綜上所述，對廣西百色地區(qū)壯族人群CR1基因rs2296160C/T、rs2274567G/A和rs4844600G/A位點的多態(tài)性研究，不僅有利于認識臨床上與CR1基因相關的多種疾病在不同種族和地域表現(xiàn)出來的差異，而且為進一步的人類學及群體遺傳學的研究和基因多態(tài)性普查奠定了實驗基礎，并為進行疾病前瞻性研究提供了重要的分子遺傳學數(shù)據(jù)。

作者：羅斌陳文成王俊利王春芳農樂根單位：右江民族醫(yī)學院附屬醫(yī)院檢驗科