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《上海醫學雜志》2015年第六期

內質網是細胞內重要的細胞器，其功能損傷可以引起內質網應激（endoplasmicreticulumstress，ERS）。ERS是細胞內一種適應性機制，可以影響成骨細胞的功能和分化，持續或過強的ERS如果不能恢復則會誘導細胞凋亡，從而導致各種骨細胞相關性疾病發生。因此，ERS在骨生物學中的作用日益受到重視。將成骨細胞的ERS與骨發生進行聯合研究有助于病理情況下骨生物學的研究，對于骨病的發生、診斷和治療均可提供理論依據。本研究將能引起成骨細胞ERS的公認化學物衣霉素作為受試物，采用骨發生PCR芯片（包含堿性磷酸酶、骨鈣素、膠原酶家族、骨形成蛋白家族、整合素家族等與骨發生相關的84個基因）技術，觀察受試成骨細胞的成骨發生表達情況。

1材料與方法

1．1實驗材料衣霉素購自美國Sigma公司，RNA提取試劑盒（RNeasyPlusMiniKit）、第一鏈合成試劑盒（RT2FirstStrandKit）、熒光染料（RT2SYBRGreenqPCRMastermix）、PCR芯片（未折疊蛋白反應PAHS－089ZA－2和骨發生PAHS－026ZA－2）均購自德國Qiagen公司。

1．2細胞培養原代培養人成骨細胞由鐘近潔教授贈送［4］，以2．5％的Ⅱ型膠原酶消化引產胚胎四肢長骨，建立原代培養人成骨細胞，經過骨結節和堿性磷酸酶鑒定。人成骨細胞在含10％FBS的DMEM培養基于37℃、體積分數為0．05的CO2培養箱中進行貼壁培養，每2～3d根據細胞生長的密度和培養液酸堿度的變化更換培養液，當細胞匯合度達到80％時進行傳代培養。

1．3PCR芯片檢測衣霉素先溶于DMSO中配制成50mg／L儲備液，臨用前配制成應用液。根據之前的實驗結果應用0和2mg／L衣霉素干預人成骨細胞24h后，提取RNA。應用NanoDrop分光光度計測定其濃度，瓊脂糖凝膠電泳測定其RNA完整性。取400ngRNA反轉錄合成cDNA，采用PCR芯片（RT2ProfilerPCRArray）進行熒光定量檢測，將cDNA模板適當稀釋后加入實時熒光定量PCR反應混合液中，然后在含有基因特異性引物的96孔板各孔中加入等量反應液，于熒光定量PCR儀（EppendorfMastercyclereprealplex2）上進行實時定量PCR反應。計算每張PCR芯片中每一基因的每個反應管內熒光信號達到設定域值時所經歷的循環數（Ct值）。每個處理組重復用PCR芯片測定3次。采用ΔΔCt方法比較相應基因的表達量變化，表達量差異在2倍以上者為差異有意義基因。

2結果

2．1RNA電泳結果可見18S和28S兩條帶，且28S條帶的亮度是18S條帶的兩倍，鑒定結果顯示樣品RNA無明顯降解，符合芯片檢測要求。

2．2芯片測定的質量控制基因組DNA控制顯示無基因組DNA污染，反轉錄控制和陽性PCR控制顯示RNA純度高，完全能滿足實時熒光定量PCR的要求。

2．3未折疊蛋白反應通路檢測結果表達上調的基因有39個：ATF4、ATF6、CALR、CANX、CEBPB、CHOP、DERL1、DERL2、DNAJB9、DNAJC10、DNAJC3、DNAJC4、EDEM1、PERK、IRE1α、IRE1β、ERO1L、ERO1LB、ERP44、HERPUD1、HSPA1L、HSPA2、BIP、MANF、NUCB1、OS9、PDIA3、GADD34、RNF139、RPN1、SEC63、SEL1L、SELS、SERP1、SYVN1、UGGT1、USP14、VCP、XBP1。無基因表達下調。各基因的功能分類：誘導內質網相關性降解的基因包括CALR、CANX、DERL1、DERL2、NUCB1、OS9、SELS、SYVN1，表達差異倍數分別為5．7120、3．0293、2．7492、4．2693、2．0763、2．5123、3．8879、7．1552；未折疊蛋白結合的基因包括DNAJB9、DNAJC10、DNAJC3、DNAJC4、UGGT1，表達差異倍數分別為19．8216、2．9980、13．5855、2．1273、2．9160；內質網蛋白質折疊的質量控制基因包括EDEM1、RPN1、SEC63、ERP44，表達差異倍數分別為5．1480、2．2799、3．1580、3．2021；翻譯調節基因為SERP1，表達差異倍數為5．042；泛素化基因包括HERPUD1、RNF139、SEL1L、USP14，表達差異倍數分別為24．7439、2．1273、11．8680、2．0835；轉錄因子基因包括ATF4、ATF6、CEBPB、CHOP、XBP1、IRE1α、IRE1β，表達差異倍數分別為2．9980、2．0195、3．4919、77．3860、3．0084、9．9108、2．4267；凋亡相關基因包括GADD34、PERK、MANF、VCP，表達差異倍數分別為8．6278、5．1124、12．8973、2．1871；熱休克蛋白基因包括HSPA1L、HSPA2、BIP，表達差異倍數分別為2．5036、2．0980、27．1711；蛋白質二硫鍵異構化基因包括ERO1L、ERO1LB、PDIA3，表達差異倍數分別為3．2021、14．6619、3．7947。

2．4骨發生信號通路檢測結果表達上調基因有10個：ALPL、COL10A1、COL15A1、FGF2、ITGAM、MMP10、SMAD1、SP7、TGFB2、VEGFA。表達下調的基因有5個：COL1A1、COL3A1、TGFB3、TGFBR2、NOG。各基因的功能分類：膠原家族基因包括COL10A1、COL15A1、COL1A1、COL3A1，表達差異倍數分別為2．7094、3．1449、0．3116、0．1495；整合素α家族基因為ITGAM，表達差異倍數為2．3916；基質金屬蛋白酶（MMP）家族基因為MMP10，表達差異倍數為2．3262；血管生長因子（VEGF）家族基因為VEGFA，表達差異倍數為2．0534；鈣離子結合與穩定基因為FGF2，表達差異倍數為5．2525；成骨細胞分化基因包括NOG、SP7，表達差異倍數分別為1．6742、2．2548；轉錄因子基因為SMAD1，表達差異倍數為2．9959；成骨作用基因包括ALPL、TGFB2、TGFB3，表達差異倍數分別為3．1016、2．7473、0．4724；生長因子和受體基因為TGFBR2，表達差異倍數為0．4642。

3討論

各種危險因素能改變內質網壓力感受蛋白肌醇需要酶1（inosi－tolrequiringenzyme1，IRE1）、蛋白激酶受體樣內質網激酶（proteinkinasereceptor－likeERkinase，PERK）和激活轉錄因子6（activatingtranscriptionfactor6，ATF6）等的表達和活性，誘發ERS［6］。內質網通過激活未折疊蛋白反應保護由ERS所引起的細胞損傷，恢復細胞功能，包括暫停早期蛋白質合成、內質網分子伴侶和折疊酶的轉錄激活、內質網相關性降解（ER－associateddegradation，ERAD）的誘導。

熒光定量PCR芯片是目前較為簡單實用的檢測基因表達的方法，能夠一次性檢測84個與未折疊蛋白反應相關的基因在mRNA水平上的表達，結果無需再進行實時熒光定量檢測，具有靈敏度高、特異性強、擴增效率高、均一性好的優點，可同時研究信號通路上的大量基因，有效避免單個基因研究的盲目性。本研究利用這一技術研究衣霉素作用下成骨細胞ERS和骨發生信號通路，有利于較完整地了解這兩方面的變化情況。ERS以內質網分子伴侶（BIP）等表達增多和ERS特異的轉錄因子CHOP（又名GADDl53）表達明顯上調為主要特征。從本實驗PCRArray檢測結果可見，ERS標志性基因BIP和CHOP表達水平均升高，證實了ERS的存在。ERS時PERK信號途徑為PERK→EIF2A→ATF4→CHOP，在本研究中以上4種基因表達均上調，顯示ERS時該通路充分被激活。ERS時IRE1途徑為IRE1→XBP1→CHOP，ATF6途徑是與IRE1共用下游的XBP1，后者的下游可以為CHOP，本研究中這兩種信號通路上的基因表達均上調。綜合以上數據，顯示衣霉素誘導成骨細胞ERS，且3條信號途徑均被激活。

在衣霉素的作用下成骨細胞發生ERS同時也促進凋亡相關基因表達上調，如典型的ERS信號分子CHOP表達上調。此外，在本研究中衣霉素還激活了一些凋亡相關基因，如果細胞不能正確、及時處理未折疊蛋白反應，成骨細胞將進入凋亡階段。當成骨細胞發生ERS后，對成骨細胞的骨發生功能也產生影響，主要是損傷了成骨細胞骨化、分化和膠原的合成等功能。其中SP7與ALPL在成骨ERS時處于高表達已經獲得證實。而SMAD1和TGFB2等基因表達上調，提示TGFB1信號通路與ERS信號通路可能存在交集。COL1A1表達下調，表明合成膠原受損。而MMP10屬于基質溶解素類，降解Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ型膠原蛋白，以及纖維連接蛋白和層粘連蛋白等，與破骨細胞活動密切相關，還參與了血管的發生和骨的重塑等，其高表達表明骨轉化過程中破骨、溶骨作用增強。本研究雖然獲取了ERS和骨發生兩方面的差異表達基因數據，一方面其蛋白表達和功能活性尚需驗證，另一方面仍需尋找能將兩者相互聯系、相互調控的關鍵靶點基因或信號通路，以便更好地了解成骨細胞ERS時的生理和（或）病理意義，對闡明骨科相關疾病（如成骨不全癥、氟骨癥）具有重要的理論意義。

作者：張亞樓 廖禮彬 馮樹梅 李甜 郝子怡 張之璐 潘娟 陳亞茹 鐘近潔 單位：新疆醫科大學基礎醫學院組織學與胚胎學教研室