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《世界中西醫(yī)結(jié)合雜志》2015年第五期

1實(shí)驗(yàn)方法

1．1銀翹散與給藥方法煎煮2次，合并濾液，過濾，濃縮至（生藥）2g／ml，流感病毒感染小鼠造模后1d開始給藥，陽性對(duì)照組給藥為磷酸奧司他韋溶液（10g／kg）；銀翹散組（10g／kg）。小鼠灌胃給藥0．1ml／10g，每天同時(shí)間點(diǎn)灌胃1次，正常組和模型組每天以等體積的蒸餾水灌胃，連續(xù)灌胃給藥6d。

1．2分組與造模／實(shí)驗(yàn)方法

1．2．1流感病毒半數(shù)致死量（LD50）的測(cè)定30只BALB／c小鼠，隨機(jī)分成6組，每組5只，戊巴比妥鈉溶液小鼠腹腔注射麻醉，用4℃預(yù)冷PBS將增毒后的流感病毒新鮮尿囊液10倍梯度稀釋，共設(shè)6個(gè)濃度，分別為10－1～10－6，將稀釋好的6個(gè)濃度梯度流感病毒分別以20μl／只滴鼻造模，觀察14d，分別觀察小鼠發(fā)病狀態(tài)，記錄流感病毒各梯度稀釋組的死亡數(shù)，計(jì)算死亡率，按Reed＆Meunch法計(jì)算病毒的半數(shù)致死量（LD50）［2］。

1．2．2銀翹散存活實(shí)驗(yàn)分組和流感病毒感染小鼠模型建立40只Balb／c小鼠，隨機(jī)分為4組，每組10只，分別為正常組、模型組、陽性對(duì)照組、銀翹散組，適應(yīng)性喂養(yǎng)48h。取凍存的流感病毒，冰上解凍，用4℃PBS（pH＝7．4）將其稀釋為每20μl含4個(gè)LD50的病毒稀釋液。戊巴比妥鈉腹腔注射麻醉，正常組以20μlPBS滴鼻造模，其余組以20μl病毒稀釋液滴鼻造模。

1．2．3銀翹散對(duì)流感病毒感染小鼠肺指數(shù)影響作用160只BALB／c小鼠，隨機(jī)分為16組，每組10只，分別為正常組1組，模型組5組，陽性對(duì)照5組、銀翹散5組，適應(yīng)性喂養(yǎng)48h后進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。造模后，分別于第1、3、5、7、9、11、13天每組隨機(jī)取3只小鼠，禁食不禁水4h，稱重，摘眼球方式取血，打開胸腔，無菌條件下取出全肺，生理鹽水洗滌2次，濾紙吸干肺組織多余水分，稱量肺重，計(jì)算肺指數(shù)。肺指數(shù)＝［肺重（g）／體重（g）］×100。

1．2．4肺總RNA提取和逆轉(zhuǎn)錄取50mg肺組織，置于EP管中，向EP管中加入10倍體積TRIzol，加入研磨球，放入研磨儀中60Hz，研磨30s；將勻漿液吸至無RNA酶EP管中，室溫靜置5min，加入100μl氯仿，上下顛倒震蕩15s，4℃，12000g離心10min，吸取上部水相，移至新EP管中，加入300μl異丙醇，混勻，室溫靜置10min，4℃，12000g離心10min，吸取液相，加入1ml75％乙醇洗滌沉淀，7500g離心5min，棄上清，室溫風(fēng)干5min，加入無RNA酶水，金屬浴55℃溶解10min，檢測(cè)RNA完整性后，放－70℃保存?zhèn)溆?。將模板RNA在冰上解凍，將5×gDNABuffer、FQ－RTPrimerMix、10×FastRTBuffer、RNase－freeddH20室溫下解凍，解凍后放冰上。其中去除基因組DNA體系為5×gDNABuffer2μl，模板RNA2μl，RNase－freeddH206μl，混勻，簡(jiǎn)短離心后置于金屬浴42℃孵育3min，置于冰上，然后分別加入10×FastRTBuffer2μl，RT－EnzymeMix1μl，F(xiàn)Q－RTPrimerMix2μl，RNase－freeddH205μl至上步反應(yīng)體系中，42℃孵育15min，95℃孵育3min后得cDNA，4℃保存。

1．2．5實(shí)時(shí)熒光定量PCR（RealTime－PCR）檢測(cè)病毒拷按照SuperRealPreMixPlus（SYBRGreen）熒光定量PCR試劑盒說明書進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。根據(jù)引物設(shè)計(jì)原則，設(shè)計(jì)引物。上游引物為5′GACCAATCCTGTCACCTCTGAC3′；下游引物為5′AGGGCATTNTGGACAAAGCGTCTA3′；為消除不同RNA樣本之間的誤差，消除RNA使用量不同導(dǎo)致的誤差，設(shè)管家基因GAPDH作為對(duì)照。其中GAPDH的上游引物為5′TGGATTTGGACGCATTGGTC3′；下游引物為5′TTTGCACTGGTACGTGTTGAT3′，引物由軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院合成。加試劑和模板（只取第3天和第6天模板）加于PCR管中建立反應(yīng)體系，將PCR管置于PCR儀中進(jìn)行反應(yīng)，反應(yīng)體系為20μl，反應(yīng)程序條件：50℃25min，92℃3min，92℃15s，55℃20s，68℃20s，37℃30s，共設(shè)置40個(gè)循環(huán)。每個(gè)樣品重復(fù)3次，將得到的Ct（thresholdofcycle）值進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析［3］，流感病毒拷貝＝2－（樣本Ct值－相應(yīng)GAPDHCt值）。

1．3統(tǒng)計(jì)學(xué)處理采用SPSS13．0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，所有實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以均值±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示。采用SPSS17．0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，多組間差異采用單因素方差分析（one－wayANOVA），以P＜0．05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，P＜0．01為差異有極顯著性差異。

2結(jié)果

2．1小鼠半數(shù)致死量（LD50）測(cè)定小鼠感染病毒第3天，10－1～10－4稀釋病毒感染小鼠均出現(xiàn)體重降低、聳毛、顫抖、喘息、進(jìn)食減少，聚堆，等癥狀；第5天開始感染小鼠開始行走搖擺不定，活動(dòng)減少，除10－6組外，其余各組于第6天開始出現(xiàn)死亡情況。共觀察14d，統(tǒng)計(jì)各組小鼠死亡數(shù)目（見表1），經(jīng)計(jì)算得出流感病毒的LD50為10－4．39。

2．2銀翹散對(duì)流感病毒感染小鼠的死亡保護(hù)作用流感病毒感染正常小鼠后，模型組的動(dòng)物死亡率為100％，平均存活天數(shù)為5．31d，陽性對(duì)照組和銀翹散組較模型組的死亡率顯著降低，平均存活天數(shù)顯著增加（P＜0．01），可見陽性對(duì)照組和銀翹散組可有效保護(hù)流感病毒感染小鼠，提高生存率。結(jié)果見表2。

2．3銀翹散對(duì)流感病毒感染小鼠模型肺臟病毒滴度的影響實(shí)驗(yàn)分別取小鼠感染第3天和第5天的逆轉(zhuǎn)錄的cDNA進(jìn)行realtime－PCR實(shí)驗(yàn)，結(jié)果顯示：正常組小鼠肺組織內(nèi)無病毒載量表達(dá)；采用甲型流感病毒感染正常小鼠后，模型組各點(diǎn)小鼠肺組織病毒載量均顯著表達(dá)（P＜0．05），感染后給予用藥的陽性對(duì)照組及銀翹散組中，銀翹散組在感染后第3天和第5天病毒載量均顯著低于同時(shí)間點(diǎn)模型組（P＜0．05）。這表明銀翹散具有較好的抑制流感病毒作用。結(jié)果見表3。表3銀翹散對(duì)流感毒感染小鼠肺臟病毒載量的影響（x±s）組別劑量（g•kg－1）病毒拷貝（copies）3d5d正常組－00模型組－5．75×106±2．14×105a7．35×106±3．17×105a陽性對(duì)照組102．29×106±1．79×105ab3．51×105±1．29×104ab銀翹散組54．65×106±1．53×105b5．79×106±1．25×105b注：與正常組比較，aP＜0．05；與模型組比較，bP＜0．05

2．4銀翹散對(duì)流感病毒感染小鼠肺指數(shù)的影響結(jié)果顯示，流感病毒感染正常小鼠后，模型組小鼠的肺指數(shù)持續(xù)增加，在第7天達(dá)到最高值，在第9天時(shí)全部死亡，說明成功建立流感病毒小鼠模型。銀翹散組除第9天時(shí)肺指數(shù)略高于模型組外，其余各個(gè)時(shí)間點(diǎn)均低于模型組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0．01）。陽性對(duì)照組各個(gè)時(shí)間點(diǎn)的肺指數(shù)均低于模型組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0．01）。銀翹散組的肺指數(shù)要高于陽性對(duì)照組，提示陽性對(duì)照組對(duì)小鼠感染流感模型的保護(hù)作用要優(yōu)于銀翹散組?？傮w上，銀翹散組在肺指數(shù)指標(biāo)上對(duì)流感感染小鼠具有保護(hù)作用。結(jié)果見表4。

3討論

目前，流感仍是嚴(yán)重威脅人類健康的流行性疾病。中醫(yī)學(xué)認(rèn)為流感屬“瘟病”范疇，由人體感受風(fēng)邪病原侵襲，機(jī)體免疫力低下，不足以抗邪而得病，具有極強(qiáng)的傳染性，是能夠引起大范圍流行的外感熱病［4］。中藥治療疾病的基本原則為扶正祛邪，中藥抗流感的作用機(jī)制可能是通過阻斷流感病毒侵入宿主過程中的吸附、穿入、復(fù)制、成熟中的某一環(huán)節(jié)而直接抑制病毒，并通過提高機(jī)體的免疫功能，促進(jìn)機(jī)體的特異性和非特異性免疫功能而間接抑制病毒［5］；中藥抗流感同時(shí)重視病毒—機(jī)體—藥物三者之間的辨證施治關(guān)系，不僅可以清除體內(nèi)流感病毒，同時(shí)還能改善機(jī)體狀態(tài)，通過調(diào)動(dòng)機(jī)體免疫功能來增強(qiáng)抗病毒感染的能力，相比于化學(xué)藥物，具有優(yōu)越性。中藥在抗流感病毒方面通過抑制病毒復(fù)制、調(diào)節(jié)免疫功能、改善血液循環(huán)、解熱鎮(zhèn)痛、抗菌消炎等多途徑發(fā)揮作用，相關(guān)藥理研究［6］也發(fā)現(xiàn)銀翹散具有抗金黃色葡萄球菌等作用。通過動(dòng)物實(shí)驗(yàn)探討中藥抗流感病毒的效果，是從整體水平反映機(jī)體內(nèi)抗病毒作用的有效途徑。中藥方劑的藥效作用是通過機(jī)體的整體作用來體現(xiàn)，因此動(dòng)物實(shí)驗(yàn)在抗流感病毒研究中具有十分重要的意義。本實(shí)驗(yàn)按郭元吉［7］的小鼠感染流感病毒模型的方法，用甲型流感病毒FM1毒株滴鼻感染正常Balb／c小鼠，造成流感病毒性肺炎小鼠模型，以死亡率、肺指數(shù)和肺臟病毒拷貝為評(píng)價(jià)指標(biāo)，評(píng)價(jià)銀翹散的抗流感病毒FM1株作用。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，銀翹散可以提高感染小鼠的存活率，延長(zhǎng)銀翹散用藥組存活時(shí)間和降低肺臟病毒載量，說明銀翹散在體內(nèi)防治流感方面具有較好療效，能夠改善病毒感染所致機(jī)體的病變。充分體現(xiàn)了中醫(yī)治療的整體觀，也一定程度上揭示了中藥抗流感病毒在扶正與祛邪方面的科學(xué)性。

作者：張照研 張會(huì)敏 周喆 王升啟 單位：．河南中醫(yī)學(xué)院 山東省中醫(yī)藥研究院 軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院