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《生理學報》2016年第二期

摘要：

癌痛是臨床晚期惡性腫瘤患者常見的臨床表現之一。其中，以肺癌、乳腺癌和前列腺癌等骨轉移引起疼痛尤為嚴重。p2x7受體是ATP門控離子通道型嘌呤能受體的一個亞型，在脊髓背角主要表達在膠質細胞。P2X7受體激活可以促進膠質細胞釋放多種炎癥介質，介導脊髓中樞敏化。該受體在炎癥痛及神經病理性疼痛中的作用已多有報道，但在癌痛中的作用尚有爭議。本研究采用C57BL/6J小鼠股骨骨髓腔內接種Lewis肺癌細胞所誘導的骨癌痛小鼠模型，分析對比了野生型小鼠和P2X7受體基因敲除(P2rx7/)小鼠骨癌痛的發生、發展。野生型C57BL/6J小鼠股骨骨髓腔內接種Lewis肺癌細胞后，患側后肢分別在第7和第14天開始出現明顯的觸誘發痛和熱痛過敏，并呈進行性加重；CatWalk步態分析顯示骨癌第21和28天，小鼠患側腳印面積明顯減小，站立時相持續時間縮短，舉步時相持續時間顯著延長；組織病理學結果顯示受累骨骨髓腔有大量腫瘤細胞浸潤，骨髓質正常結構消失，伴有髓質骨和皮質骨的破壞。與研究設計時的預期相反，P2rx7/小鼠接種瘤細胞后，患肢痛行為檢測結果與野生型小鼠相似，甚至在CatWalk步態分析檢測值變化發生的時間上較野生小鼠有所提前。這與本研究組前期在大鼠骨癌痛模型觀察到的阻斷P2X7受體明顯對抗骨癌痛的結果完全不同，提示P2X7受體在大、小鼠骨癌痛中可能發揮不同的作用，并再次提示疾病動物模型上的研究結果與人類疾病機理之間還存在巨大差異。

關鍵詞：

骨癌痛；小鼠；P2X7受體；基因敲除；小膠質細胞

癌痛即惡性腫瘤所引起的疼痛，是慢性痛中最嚴重也最難以控制的疼痛之一。許多常見的腫瘤如乳腺癌、肺癌、前列腺癌等容易發生骨轉移，約有75%~95%的轉移性骨癌患者伴有嚴重疼痛[1]，極大降低了患者的生活質量，也給臨床治療帶來很多困擾。在目前常用的“三階梯”癌痛管理治療手段下，仍有45%的患者疼痛得不到有效控制[2,3]。因此，揭示癌痛發生機理，尋求更有效的緩解癌痛方法成為迫切需要解決的問題。隨著多種模擬臨床骨轉移瘤動物模型的建立，對骨癌痛的機理研究成為可能[4]。ATP作為重要的神經遞質[5]和膠質遞質[6]，在脊髓傷害性信息傳遞中起關鍵性作用[7,8]。嘌呤能離子通道型受體是ATP門控的離子通道受體家族成員，在脊髓優勢地表達在小膠質細胞[9,10]。本研究組以往的研究顯示，神經損傷或嗎啡鎮痛耐受顯著上調大鼠脊髓P2X7受體表達，活化脊髓小膠質細胞；阻斷P2X7受體可抑制神經病理性痛和嗎啡耐受行為，提示其參與神經病理性疼痛和嗎啡鎮痛耐受的發生[10–12]。來自其它實驗室的研究也一致性揭示，脊髓小膠質細胞表達的P2X7受體廣泛參與炎癥痛和神經病理性痛的發生[13–15]。最近，本研究組在Walker256乳腺癌細胞誘導的大鼠骨癌痛模型上觀察到，P2X7受體介導的脊髓小膠質細胞激活對進展期骨癌痛的維持(而不是發生)起重要作用，提示了P2X7受體在骨癌痛中的作用與炎癥痛和神經病理性痛的差異[16]。更為有趣的是，在4T1乳腺癌細胞誘導的小鼠骨癌痛模型，Hansen等發現P2X7受體缺陷的C57BL/6-BALB/cJ雜交小鼠表現出對骨癌痛的易感[17]，提示該受體在不同種屬骨癌痛模型中的作用可能相反。考慮到Hansen等使用的4T1乳腺癌細胞只能在BALB/cJ小鼠成瘤，而P2X7受體基因敲除(P2rx7/)小鼠是C57BL/6背景的，通過兩種品系小鼠雜交獲得的P2rx7/小鼠可能存在P2X7受體的剪切突變體[P2X7(k)][17–19]，該突變體在脊髓中有大量表達，可能代償P2X7受體的功能。為進一步明確P2X7受體在小鼠骨癌痛中的作用，本研究采用Lewis肺癌細胞在C57BL/6J背景的P2rx7/小鼠誘導骨癌痛，一方面不存在P2X7(k)的代償作用，另一方面也避免了乳腺癌細胞更適合接種到雌鼠的性別局限性。我們通過建立C57BL/6J小鼠骨癌痛模型，檢測P2rx7/小鼠在骨癌痛發生、發展過程中的行為學變化，以期為揭示P2X7受體在骨癌痛中的作用提供新的實驗證據。

1材料與方法

1.1實驗動物6~8周齡C57BL/6J小鼠(雌雄不拘)，購自中國科學院上海實驗動物中心，許可證號SCXF(滬)2007-2005。P2rx7/小鼠購自TheJack-sonLab。飼養環境保持12h/12h明暗間隔的人工晝夜節律，自由攝食和飲水。對實驗動物進行的所有研究行為均嚴格遵照國際疼痛研究學會的相關動物保護及使用規定，并獲得復旦大學實驗動物中心動物倫理委員會批準。

1.2主要儀器vonFrey纖毛(Stolting公司，美國)，336型輻射熱測試儀，CatWalk步態分析系統。

1.3小鼠股骨癌痛模型制備

1.3.1Lewis肺癌細胞的培養Lewis肺癌細胞購自中國科學院上海細胞庫。將細胞貼壁培養于含10%胎牛血清的DMEM高糖培養基(Gibco公司，美國)中，置于含5%CO2的37℃恒溫培養箱(Thermo公司，美國)中培育，每1~2天進行1:2傳代。收集細胞時，舍棄培養基，用0.125%胰蛋白酶消化貼壁細胞。1min后用含血清的培養基終止酶反應，1000r/min離心5min，沉淀溶于PBS制成細胞懸液。取5~10μL細胞懸液計數，密度達到2×108個/mL方可使用。操作時將細胞置于冰上，2h內完成細胞接種，以保持癌細胞活性。

1.3.2細胞接種小鼠腹腔注射4%戊巴比妥鈉(100mg/kg)麻醉。小鼠仰臥位，左側后肢剃毛，用絡合碘和酒精消毒皮膚。彎曲小鼠膝關節，可見白色髕韌帶。用4號針頭繞過髕韌帶，從近髁間窩位置進針，按股骨長軸方向鉆孔進入股骨骨髓腔后，換用微量進樣器(依次吸取1μL空氣+2μL明膠海綿溶液+1μL空氣+5μL腫瘤細胞)向骨髓腔內接種腫瘤細胞(1×106個)，明膠封口，留針片刻后退出針頭，無菌棉簽沾生理鹽水清洗傷口，酒精棉球擦拭傷口處進行消毒。對照組用PBS代替腫瘤細胞，其余操作均相同。

1.4行為學測試

1.4.1vonFrey測試用vonFrey法測定小鼠對機械刺激誘發的縮爪反應閾值，其原理是利用不同克數的纖毛壓力作用于小鼠腳掌中心，以引起小鼠縮爪反應的最小克數作為小鼠PWT。將小鼠置于8.8cm×8.8cm×4.4cm的有機玻璃盒內，放在間距2mm的金屬網格之上，室溫控制在(23±2)℃，保持環境安靜。測試前3天將小鼠放置于測試環境適應，每天至少2h。測試時，提前將小鼠放入測試環境0.5h，按照壓力遞增順序依次使用從0.16g到4g的vonFrey纖毛，對小鼠后爪掌中心后方位置進行刺激，以纖毛適度彎曲作為受力標準。每種強度的纖毛刺激5次，每次刺激持續3s，刺激間隔30s以上，以引起快速反射性縮爪反應作為有效反應。至少3次能夠引起有效反應的vonFrey纖毛強度作為小鼠PWT。

1.4.2Hargreaves測試采用Hargreaves法測定小鼠對輻射熱刺激誘發的縮爪反應潛伏期，其原理是利用鹵鎢絲燈發出的輻射熱刺激小鼠腳掌中心，引起小鼠縮爪反應，從熱刺激開始到小鼠產生縮爪反應的時間定義為PWL。測試使用8.8cm×8.8cm×4.4cm的有機玻璃盒，置于距離桌面30cm高的透明雙層玻璃平臺上，玻璃平臺夾層中有電熱金屬絲對平臺進行加熱，維持實驗動物足底溫度恒定。室溫控制在(23±2)℃，保持環境安靜。測試前3天將小鼠放置于測試環境適應，每天至少2h。正式測試時，提前將小鼠放入測試環境0.5h，用輻射熱刺激小鼠腳掌中心，刺激器自動記錄從刺激開始至動物反射性縮爪的時間。為了防止測試對實驗動物造成實質性的損傷，設定每次刺激時間上限為15s，同一只后爪每兩次測試之間的間隔不少于10min，以三次測量的平均值作為該動物的PWL。

1.4.3CatWalk步態分析使用CatWalk步態分析系統對運動中的小鼠進行步態測定分析。該裝置主要由內置熒光燈的上蓋、玻璃底板通道和高頻攝像頭組成。測試前，小鼠預先置于測試環境下30min。室溫控制在(23±2)℃，室內開紅色光照，保持環境安靜。測試時，將小鼠輕輕放在CatWalk通道的起始端，通道寬度設置為小鼠寬度的1.5倍，由小鼠自行穿過走廊，選取20cm的距離進行記錄，通過時長約1~2s。當小鼠的腳掌與玻璃平板的表面接觸時，光線向下反射，使得下方的高速攝像頭捕捉到清晰的腳印圖像傳送到計算機，通過相應程序進行分析，獲得小鼠雙側腳掌接觸底板的腳印面積、站立時相持續時間(standphase，小鼠腳掌每次接觸底板的時間)和舉步時相持續時間(swingphase，小鼠腳掌兩次接觸底板的間隔)。在一次測試中，將站立和舉步時相持續時間分別求平均值，即為該次測試中小鼠某側腳的站立和舉步時相持續時間，每只小鼠在一次測試中至少重復3次。腳印面積在一定程度上反映行走過程中肢體的承重狀態；站立時相持續時間和舉步時相持續時間與受累側肢體的疼痛和動物的保護性行為相關[20]。合格的測試需滿足：腳印數≥10個，動物走動時間在0.5~5s，速度方差小于40。

1.5組織學檢測骨癌第28天，行為檢測結束后，隨機選取部分骨癌痛小鼠過量麻醉處死，取雙側后肢股骨，放入4%多聚甲醛固定，經脫鈣(4天)、脫水(2天)、透明、石蠟包埋、切片(5μm厚)、貼片、脫蠟、HE染色、脫水透明和封片等步驟后，于顯微鏡下觀察股骨骨質破壞和腫瘤細胞生長情況，并用CCD采集圖像。

1.6統計分析實驗數據以mean±SEM表示。由于存在處理方法和時間點雙重因素，均值間差異的顯著性檢驗采用雙因素方差分析和Holm-Sidak兩兩比較，并定義P<0.05為顯著性界值。

2結果

2.1小鼠骨癌誘發痛覺敏化的時間過程瘤細胞接種后14~28天，小鼠術側后肢出現明顯的熱痛過敏，與假手術組相比差異顯著。與熱痛過敏相比，機械刺激引起的觸誘發痛在腫瘤小鼠出現較早，瘤細胞接種后7天即出現明顯的觸誘發痛，持續至28天。腫瘤小鼠對側后肢對熱刺激和機械刺激的反應閾值在各檢測時間點間無顯著變化(圖1C，D)。進一步，我們通過CatWalk步態分析對骨癌小鼠行走時患側腳印面積、站立和舉步時相持續時間等進行了檢測。如圖2顯示，在骨癌第21和28天，與對側相比，患側腳印面積和站立時相持續時間顯著縮短，舉步時相持續時間明顯延長。雙因素方差分析顯示明顯的同、對側差異小鼠骨癌第28天，行為檢測結束后，取術側股骨病理學切片檢測腫瘤細胞浸潤和骨質破壞情況。HE染色結果顯示，術側股骨遠端腫瘤細胞大量浸潤，骨髓質破壞，正常的骨小梁結構丟失(圖3)。

2.2P2X7受體基因敲除對小鼠骨癌痛發展的影響如前所述，P2X7受體在炎癥痛和神經病理性痛發生中扮演重要角色，但在癌痛條件下，依接種的瘤細胞系和動物種屬不同，P2X7受體的作用顯示出相互矛盾的結果。本研究在P2rx7/小鼠進一步觀察Lewis肺癌細胞股骨骨髓腔接種誘導骨癌痛敏行為發生、發展的時間過程。與我們的預期相反，P2rx7/小鼠在腫瘤接種后。

3討論

P2X7受體已被廣泛證明參與慢性痛的中樞敏化過程[12,21]。2005年，Chessell等研究者發現在炎癥痛和神經病理性痛動物模型中，P2rx7/小鼠的痛覺敏化行為明顯減弱[22]。本實驗室前期的工作也顯示，大鼠鞘內給予P2X7受體抑制劑或siRNA敲減脊髓背角P2X7受體明顯對抗嗎啡鎮痛耐受[10,11]和高頻刺激坐骨神經引起的痛覺敏化行為[12]。然而，骨癌痛作為一種機制復雜而獨特的慢性痛，P2X7受體在其中的作用尚有爭議[16,17]。本研究采用C57BL/6J背景的野生型和P2rx7/小鼠，在股骨骨髓腔內接種Lewis肺癌細胞建立小鼠骨癌痛模型，觀察和比較其痛相關行為的改變。臨床上，肺癌、乳腺癌和前列腺癌骨轉移引起的骨癌痛是惡性腫瘤誘發的慢性痛中最為嚴重的一種，難以有效控制，嚴重影響了腫瘤患者的生活質量。為了深入研究骨癌痛的發生機理，發展更為有效的治療手段，目前已建立多種骨癌痛動物模型。這些模型依動物品系、性別、腫瘤細胞系和接種部位的不同而有所差異，特別是不同腫瘤細胞系的在體成瘤環境不同，適宜接種的動物種屬、品系和性別也各不相同[4]。例如，Walker256乳腺癌細胞株多選用雌性大鼠脛骨骨髓腔接種[16]，4T1乳腺癌細胞株多選用BALB/cJ和C3H/SCID小鼠股骨骨髓腔接種[17]。然而，目前多種基因工程小鼠選用C57BL/6J品系，該品系具有自發性腫瘤低、應激反應均一等優勢，但用于骨癌痛模型動物研究很少。本實驗嘗試選用來源廣泛、易于獲得、致瘤作用極強的Lewis肺癌細胞接種C57BL/6J小鼠股骨骨髓腔，建立了穩定、重復性好、無性別選擇性的小鼠骨癌痛模型。隨腫瘤生長，受累肢體出現進行性加重的熱痛過敏和觸誘發痛(圖1)以及移動肢體誘發的疼痛(步態異常，圖2)；組織病理切片HE染色結果顯示，腫瘤受累骨骨質破壞明顯，正常骨髓質結構丟失，骨髓腔內有大量癌細胞浸潤(圖3)。這些結果提示，該模型較好地模擬了臨床上腫瘤骨轉移的特征，包括骨質破壞、患者隨病程發展出現輕觸或移動引發劇烈疼痛等現象[23]。值得一提的是，我們在本實驗中采用了一種更為客觀的小鼠行為檢測方法——CatWalk步態分析。通過計算機的實時分析，該方法可以檢測運動中小鼠四只腳掌的各項參數，包括位置、壓力強度、接觸面積、運動速度等等。與vonFrey測試相比，該方法能更客觀精確地檢測小鼠的觸誘發痛和步態適應過程[24]，也在一定程度上反映出小鼠的自發痛行為[25]。該方法在急性痛[20]、炎癥痛[26]和神經病理性痛[27,28]大鼠行為檢測中有所應用，在小鼠骨癌痛行為檢測中尚無報道。本研究證明，小鼠骨癌發展至21天，患側腳印面積顯著減小，站立時相持續時間縮短，舉步時相持續時間明顯延長，這些參數反映出小鼠運動時將重心轉移至非腫瘤側的保護性行為。該方法能較大程度地避免檢測者主觀影響等其它行為測試中常見的問題，同時由于檢測快速，也方便了大樣本的行為學測量。

P2X7受體是一種嘌呤能離子通道受體，其配體ATP可作為神經遞質/調質或膠質遞質在神經細胞和膠質細胞之間介導信息傳遞，廣泛參與多種慢性痛的發生、發展過程。我們及其他實驗室以往的研究證明，阻斷P2X7受體的功能可以減輕多種類型的慢性痛，包括炎癥痛、神經病理性痛和大鼠骨癌痛[13–16]。相反，Hansen等在4T1乳腺癌細胞誘導的BALB/cJ小鼠骨癌痛模型發現，P2X7受體基因敲除增加小鼠對骨癌痛的易感[17]。由于4T1乳腺癌細胞并不能在C57BL/6J背景的P2rx7/小鼠成瘤，Hansen等通過雜交BALB/cJ野生小鼠和C57BL/6J背景的P2rx7/小鼠獲得P2X7受體基因敲除的BALB/cJ小鼠。該過程可能使P2X7受體基因敲除存在某些不確定性，如可能存在P2X7受體的剪切突變體[(P2X7(k)][17]代償P2X7受體的作用[18,19]。為進一步確認P2X7受體在小鼠骨癌痛中的作用，我們選用Pfizer開發的C57BL/6J背景的P2rx7/小鼠，在Lewis肺癌細胞誘導的C57BL/6J小鼠骨癌痛模型上進行該項研究。與Hansen等在不同腫瘤細胞系和不同品系小鼠上的結果相類似，P2rx7/小鼠接種Lewis肺癌細胞后，癌痛的行為表現與野生型小鼠相比并無顯著差異，甚至其CatWalk步態分析參數變化發生的時間點較野生小鼠有所提前。該結果進一步證實，在小鼠骨癌痛模型，P2X7受體不參與骨癌誘發痛覺敏化的發生和發展。結合我們前期關于P2X7受體在大鼠骨癌痛中的作用研究[16]，本工作結果提示P2X7受體在大、小鼠骨癌痛中可能發揮完全不同的作用。這種差異可能與大、小鼠骨癌痛條件下膠質細胞不同的激活情況有關，如在多個大鼠骨癌痛模型可觀察到脊髓背角小膠質細胞的大量活化，但在小鼠骨癌模型，脊髓小膠質細胞活化少有報道[29,30]。已知P2X7受體主要表達在脊髓背角小膠質細胞，P2X7受體與脊髓小膠質細胞活化之間的關系在不同種屬骨癌痛發生中的作用還有待進一步研究。另外，用于大、小鼠骨轉移瘤模型的瘤細胞系是不同的，而不同品系的瘤細胞破壞骨質時形成不同微環境所造成的影響可能也對這種品系差異有所貢獻[31]。這些結果再次提示，在疾病動物模型上所得的研究結果與人類疾病機理之間還存在著巨大差異。

作者：趙欣 劉慧珠 張玉秋 單位：復旦大學腦科學研究院