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《畜牧與獸醫雜志》2014年第九期

1材料與方法

1.1核酸提取取衣原體、細菌培養液或樣本懸液200μL，加入裂解液400μL，混勻，室溫靜置2～3min，先后以酚/氯仿/異戊醇(25∶24∶1)和氯仿各抽提1次，取上清加入0.8體積－20℃預冷的異丙醇，混勻，4℃12000r/min離心10min，沉淀用75%乙醇洗滌1次后，室溫干燥3～5min，加入超純水30μL溶解沉淀。裂解液:5mol/L異硫氰酸胍，0.05mol/LTris－HCl(pH6.4)，0.02mol/LEDTA(pH8.0)，1.3%TritonX－100，充分溶解后備用。

1.2熒光PCR熒光PCR反應體系:TaqMan熒光PCRMasterMix12.5μL，上、下游引物(20pmol/L)各0.5μL，探針(10pmol/L)0.25μL，DNA模板5μL，加超純水至25μL。擴增條件:95℃預變性10min后;95℃15s、57.5℃1min，40個循環。

1.3特異性分別提取CpsCB3以及雞毒支原體、雞滑液囊支原體、豬肺炎支原體、豬鼻支原體、大腸桿菌ATCC25922、痢疾志賀菌CMCC(B)51105、沙門菌ATCC14028、金色葡萄球菌ATCC25923、銅綠假單胞菌ATCC27853、霍亂弧菌ATCC51394、副溶血弧菌89001、單增李斯特菌CMCC(B)54002、蠟樣芽孢桿菌ATCC63301、甲型溶血型鏈球菌CMCC32205、阪崎氏腸桿菌ATCC29544等的DNA。用Y1和Y2熒光PCR進行擴增，分析方法的特異性。

1.4靈敏度將CpsCB3基因組DNA和已知濃度的目的DN斷分別做10倍倍比稀釋，每個稀釋度3個重復，用相應的Y1和Y2熒光PCR方法進行擴增，比較分析擴增的靈敏度。

1.5常規PCR常規PCR反應體系:常規PCRMasterMix12.5μL，上下游引物(濃度為20μmol/L)各0.5μL、DNA模板5μL，加超純水至25μL。C1的擴增程序:95℃預變性10min，94℃30s、56℃45s、72℃45s，擴增35個循環后72℃延伸10min。C2的擴增程序:95℃預變性10min，94℃30s，54℃45s、72℃45s，擴增35個循環后72℃延伸10min。X1和X2的擴增程序:95℃預變性10min，94℃30s，53℃40s、72℃1min，擴增35個循環后72℃延伸10min。

1.6臨床樣品檢測從江蘇等地的5個養鴿場、2個豬場、2個奶牛場采取了50份鴿泄殖腔拭子、20份豬肺組織、20份牛鼻腔拭子，分別用建立的Y1、Y2熒光PCR和C1和C2常規PCR進行檢測。

2結果

2.1熒光PCR擴增經過對引物和探針濃度、Mg2+和dNTPs濃度、退火溫度和時間等進行優化后，用Y1、Y2、Y3熒光PCR分別對CpsCB3、分離株1和分離株2進行擴增。發現其中Y1和Y2熒光PCR的擴增曲線呈典型的“S”型，擴增平臺期的熒光值(＞1.75)明顯比Y3熒光PCR(＜0.5)高，對相同濃度的同一模板進行擴增，Y1和Y2熒光PCR的Ct值遠小于Y3熒光PCR，故選擇Y1和Y2熒光PCR用于下一步的試驗。將Y1和Y2熒光PCR擴增產物用2.5%瓊脂糖電泳，能觀察到預期片段大小一致的單一條帶，切取目的片斷純化回收后，克隆至pMD18－TVector，送大連寶生物公司測序，發現擴增產物序列與預期一致。

2.2特異性用Y1和Y2熒光PCR對CpsCB3、雞毒支原體、雞滑液囊支原體、豬肺炎支原體、豬鼻支原體以及大腸桿菌等11種細菌的DNA進行擴增，發現除CpsCB3出現特異性擴增曲線外，其他均沒有擴增曲線，說明這2套熒光PCR具有良好的特異性。

2.3靈敏度用Y1熒光PCR對10倍倍比稀釋目的DN斷進行擴增，發現其檢測下限為7個拷貝，Ct值和DNA稀釋倍數的對數的相關性方程為Y=－3.52X+42.46，R2=0.999;Y2熒光PCR對目的DN斷的檢測下限為2個拷貝，相關性方程為Y=－3.34X+40.18，R2=0.995(表2)。用Y1和Y2熒光PCR對10倍倍比稀釋的CpsCB3基因組DNA進行擴增，發現Y1的檢測下限為108稀釋倍數，相關性方程為Y=－3.49X+14.26，R2=0.989，變異系數CV(%)為0.09%～2.2%(n=3);Y2的檢測下限為107稀釋倍數，相關性方程為Y=－3.59X+13.03，R2=0.996，變異系數CV(%)為0.57%～1.8%(n=3)，說明這2套熒光PCR具有良好的靈敏度和重復性。

2.4常規PCR經過反應條件優化后，用C1和C2、X1和X2常規PCR分別對CpsCB3、分離株1和分離株2進行擴增，產物用1.5%瓊脂糖電泳，能觀察到預期片段大小一致的單一條帶，擴增產物送大連寶生物公司測序，發現所有擴增產物序列與預期一致。并且這4套PCR對雞毒支原體、雞滑液囊支原體、豬肺炎支原體、豬鼻支原體以及大腸桿菌等11種細菌核酸不能擴增到目標條帶，說明建立的方法具有良好的特異性。其中C1和C2常規PCR對目標DN段的檢測下限依次為900拷貝和10000拷貝，對與2.3同一管CpsCB3基因組DNA溶液的檢測下限依次為105和104(表2)。

2.5初步應用將CpsCB3、分離株1和分離株2用X1和X2PCR擴增后的產物分別測序，結果用DNAStar軟件和NCBI網站上的Blast軟件進行分析。發現CpsCB3、分離株1和分離株2的16S－23SrRNA基因序列與鸚鵡熱參考株ChlamydiapsittaciMN株同源性均達99%，與其他Cps同源性為95%～99%，與其他衣原體(沙眼衣原體、肺炎衣原體和反芻動物衣原體)同源性為73%～91%;發現CpsCB3、分離株1和分離株2的MOMP基因序列與國際鸚鵡熱衣原體參考株MN株同源性都為77%，CpsCB3、分離株1和分離株2與已公布的CpsCB3株和CpsCB8株基因同源性均達99%。摘取GenBank中已報道的衣原體基因中對應X1和X2目標片段的序列進行同源性分析，發現X1和X2的擴增片段能有效將Cps區分于其他衣原體。用Y1、Y2熒光pcr和C1、C2常規PCR檢測了來源于江蘇等地的50份鴿泄殖腔拭子、20份豬肺組織和20份牛鼻腔拭子，結果均為陰性。說明建立的方法可用于臨床樣本的檢測和分析。

3討論

衣原體介于病毒和細菌之間，兼有細菌和病毒兩者的基本生物學特性，直徑0.2～1.5μm，由始體和網狀體兩個生長期組成，主要靠空氣傳播和接觸傳播［8］。目前比較公認的是分為4個種:沙眼衣原體、鸚鵡熱衣原體、肺炎衣原體和反芻動物衣原體［9］。其中鸚鵡熱衣原體分為禽源群、貓源群、流產源群和豚鼠源群4個群、8個血清型，即A、B、C、D、E、F、WC和M56，也有學者認為禽源性鸚鵡熱衣原體就有6個血清型［10］。近年來，隨著候鳥遷徙，寵物鳥的增加，動物發病和人感染的報道呈逐年上升趨勢，因此鸚鵡熱衣原體對畜牧業和人類的危害值得警惕。

鸚鵡熱衣原體全基因組約為1170kb，其中16S－23SrRNA與外膜主蛋白(MOMP)的基因序列比較保守。衣原體的16S－23SrRNA基因高度保守，且種屬間差異不大(同源性為90%以上)，如果將其作為檢測的目的基因，不易區分不同種的衣原體。鸚鵡熱衣原體MOMP與沙眼衣原體、肺炎衣原體MOMP的同源性分別為68%和71%［11］，MOMP有4個基因可變區(VDs)分別介于5個高度保守的恒定區之間，其中VD1與VD2區具有血清型特異的抗原決定簇，VD4區具有種屬特異性的抗原簇，MOMP抗原決定簇對其毒力和致病性研究以及疫苗研制方面具有重要意義［12］。目前鸚鵡熱衣原體檢測方法主要有病原分離鑒定、免疫熒光［13］、間接血凝抑制試驗［14］、補體結合試驗［15］、ELISA［16］、常規PCR［17］、熒光PCR(包括雙雜交探針的熒光PCR［18］、SYBRGreen熒光PCR［19］和MGB熒光PCR［20］)等。其中病原分離鑒定、免疫熒光、補體結合試驗、間接血凝抑制試驗等的耗時長、敏感性較低、易受主客觀因素影響;SYBRGreen熒光PCR的特異性和靈敏度低于探針類的熒光PCR，MGB熒光PCR對探針匹配性的要求極高，而鸚鵡熱衣原體內的群和血清型較多，各群各型之間存在一定的基因差異，并且野毒株之間也存在一定的變異，一旦出現某個堿基與MGB探針不匹配，就可能呈現陰性反應，有漏檢的可能。本研究建立的2套鸚鵡熱衣原體TaqMan熒光PCR具有良好的特異性、靈敏度和重復性，對基因組和雙鏈目標DNA的檢測下限明顯優于常規PCR，因此，檢測時建議優先選用TaqMan熒光PCR。由于鸚鵡熱衣原體和沙眼衣原體、肺炎衣原體、反芻動物衣原體之間的基因序列同源性比較高，衣原體各種之間的序列差異區在鸚鵡熱衣原體不同毒株之間也存在一定差異，因此，不易設計鸚鵡熱衣原體特異性的引物和探針。本研究經過反復比對，設計的引物和探針與其他衣原體的序列差異為2～10個堿基。由于鸚鵡熱衣原體的宿主種類繁多，很多宿主也能感染其他衣原體，為確保檢測的準確性，本研究進一步設計并建立了2套衣原體科的通用PCR，其包含可將鸚鵡熱衣原體與其他衣原體區分的可變區，一旦熒光PCR檢測出現陽性結果，可用衣原體通用PCR對擴增產物進行測序分析，進一步鑒別確認。筆者認為可先對樣本用具有快速、靈敏等特點且基因位點不同的2套熒光PCR進行檢測，即能對大量樣本進行快速初篩，還可避免漏檢;而后再用衣原體通用PCR進行序列確認，確保結果的準確性，避免誤檢。總之，本文建立的方法具有較好的應用前景，可為鸚鵡熱衣原體的大范圍初篩和快速診斷提有效手段，為鸚鵡熱衣原體的日常監測、流行病學調查和防控提供可行之策。

作者：唐泰山王建忠陳國強馬雪麗姚火春張常印姜焱王凱民單位：江蘇出入境檢驗檢疫局蘇州市相城區畜牧獸醫站南京農業大學動物醫學院