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《藥物分析雜志》2015年第十一期

肺炎鏈球菌在呼吸道的感染可以引起支氣管炎、肺炎、中耳炎、鼻竇炎等疾病，如果肺炎鏈球菌侵入血液則會引起腦膜炎、敗血癥等更為嚴重的疾病［1－2］。肺炎鏈球菌始終是導致兒童腦膜炎、菌血癥、肺炎等嚴重疾病的首位病原菌，是引起鼻竇炎和急性中耳炎的最常見病因，也是出生20d后小兒社區獲得性肺炎首位細菌病原。全球疫苗和免疫聯盟(GAVI)研究估計了全球小于5歲兒童肺炎鏈球菌的疾病負擔，其中中國每年有174萬兒童感染肺炎鏈球菌，占全球病例總數12%。有效安全的疫苗免疫接種是預防肺炎鏈球菌感染的有效措施，以莢膜多糖為抗原成分的多糖疫苗在2歲以下嬰幼兒中免疫效果不理想，即使在成人中也僅能產生短期、中等強度的保護作用。研究證明將多糖與蛋白載體共價偶聯形成結合疫苗，可使多糖由T細胞非依賴性抗原轉化為T細胞依賴性抗原，增強多糖的免疫原性，使嬰幼兒產生足夠的保護力［8］。已經上市的7價肺炎球菌結合疫苗和國內外均在研究開發13價肺炎球菌結合疫苗，磷酸鋁/氫氧化鋁作為佐劑，能夠延長多糖蛋白結合抗原在體內的存留時間，引起炎癥反應，刺激淋巴細胞增殖分化，提高免疫效果［9］。目前可用于鋁含量測定的方法主要有電感耦合等離子體原子發射光譜(induc-tivelycoupledplasmaopticalemissionspectrometry，ICP－OES)法、電感耦合等離子體質譜(ICPmassspectrometry，ICP－MS)法和化學滴定法等。目前肺炎球菌結合疫苗的質量標準中鋁含量的測定均采用化學滴定法(中國藥典2010年版三部)，但是該方法靈敏度低，樣品消耗量大，測定鋁含量的樣品單次用量需10mL(20支樣品)，并且此方法以肉眼判斷終點，人為誤差較大。ICP－OES法利用鋁元素發出的特征譜線進行樣品中鋁含量的測定，具有靈敏度高、干擾性小、樣品用量小(僅為2mL)等優點。本實驗參照中國藥典2010年版一部及相關文獻，建立了ICP－OES測定13價肺炎球菌結合疫苗中鋁含量的檢測方法，將微波消解法和0．1mol•L－1鹽酸直接處理法進行初步比較，選擇簡便的0．1mol•L－1鹽酸直接處理法預處理樣品從線性、重復性、加樣回收率、專屬性以及溶液穩定性等多方面進行方法學驗證，確保方法準確有效可重復，為鋁含量檢測方法的改進打下基礎。

1儀器與試藥

1．1儀器電感耦合等離子體發射光譜儀(Thermofisherscientific，Icap6300)購自美國賽默飛世爾公司;微波消解儀購自意大利麥爾斯通公司。

1．2試藥未上市的13價肺炎球菌結合疫苗由某企業提供;鋁單元素標準溶液(GSB04－1713－2004)，質量濃度為1000μg•mL－1，批號11708，購自中國計量科學研究院;硝酸(微電子級化學品，超凈高純試劑);30%過氧化氫(分析純)購自國藥集團化學試劑有限公司;濃鹽酸(分析純)購自ThermoFisher公司。

2方法與結果

2．1方法學的建立

2．1．1儀器工作條件入射功率:1．15kW;冷卻氣:氬氣;冷卻氣流量:12L•min－1;載氣流量:1L•min－1;輔助氣流量:0．7L•min－1;樣品提升量:1mL•min－1;檢測波長:308．215nm。

2．1．2標準工作溶液的制備分別精密量取鋁單元素標準溶液5、25、50、75、100μL于不同的50mL量瓶中，用1．3%硝酸溶液稀釋并定容至刻度，混勻，得1、5、10、15、20μg•mL－1標準工作溶液。

2．1．3樣品預處理方法的選擇0．1mol•L－1鹽酸稀釋處理樣品:精密量取樣品2mL于50mL量瓶中，用0．1mol•L－1鹽酸稀釋并定容至刻度，充分混勻，分析前在室溫下至少放置24h，即得供試品溶液;微波消解處理樣品:精密量取樣品2mL于消解瓶中，分別加入濃硝酸2mL，30%過氧化氫1mL，置微波消解儀中密封消解35min;待消解液冷卻后，轉移至50mL量瓶中，每份樣品瓶中加入濃硝酸1mL，并用新制超純水定容至刻度，即得供試品溶液。每種預處理方法平行制備2份供試品溶液，每份溶液連續進樣3次，結果ICP－OES法測得0．1mol•L－1鹽酸預處理后的樣品鋁含量均值為241．125μg•mL－1，RSD為1．84%;ICP－OES法測得微波消解法處理后的樣品鋁含量均值為239．686μg•mL－1，RSD為4．21%。結果表明，上述2種預處理方法處理樣品后用ICP－OES法測定鋁含量結果無顯著性差異，均適用于13價肺炎球菌結合疫苗鋁含量檢測，本研究選擇用0．1mol•L－1鹽酸稀釋法進行樣品的預處理。

2．2方法學驗證

2．2．1線性關系考察取制備好的1、5、10、15、20μg•mL－1鋁元素標準工作溶液，按照“2．1．1”項條件進行測定。以鋁元素質量濃度(μg•mL－1)為X軸，分析線的響應值為Y軸進行線性回歸，得回歸方程。結果表明鋁元素質量濃度在1～20μg•mL－1范圍內，與響應值具有良好的線性關系。

2．2．2重復性試驗取樣品(批號CN0002)9份，按照“2．1．3”項下用0．1mol•L－1鹽酸稀釋處理制備供試品溶液，應用ICP－OES法檢測，結果鋁含量的均值為216．761μg•mL－1，RSD為0．76%，表明此方法精密度良好。

2．2．3回收率試驗取已知含量的樣品(批號CN0002)9份，用0．1mol•L－1鹽酸稀釋25倍，各取15mL，平均分為3組，分別加入用0．1mol•L－1鹽酸稀釋至9．511μg•mL－1鋁標準工作溶液5、15和45mL，加入的鋁終質量濃度分別為2．3778、4．7555和7．1332μg•mL－1。室溫放置24h后，進行測定，計算回收率，回收率均在90%～110%之間。鋁含量平均回收率及RSD結果見表1。

2．2．4檢出限和定量限將空白對照溶液(去離子水)連續進樣11次，按照“2．1．1”項條件測得溶液中鋁含量，計算平均值和標準偏差(SD)值。結果顯示，空白溶液連續進樣11次，測定結果的均值為0．0055μg•mL－1，SD為0．0050μg•mL－1，檢出限為0．015μg•mL－1(3SD)，當供試品溶液濃度低于檢出限時為未檢出;定量限為0．050μg•mL－1(10SD)，當測定結果低于定量限時，樣品的測定結果被認為不可靠。

2．2．5專屬性考察0．04%氯化鈉0．1mol•L－1鹽酸、0．1mol•L－1氯化鋰0．1mol•L－1鹽酸和1．3%硝酸溶液分別作為陰性對照1、陰性對照2和陰性對照3。陰性對照1、2和3放置24h后進行鋁含量檢測。從結果中可以看出，陰性對照1、陰性對照2和陰性對照3的測定值均低于檢出限，說明0．04%氯化鈉、0．1mol•L－1鹽酸、0．1mol•L－1氯化鋰0．1mol•L－1鹽酸和1．3%硝酸不影響鋁含量的檢測。結果見表2。

2．2．6溶液中鋁含量穩定性研究取樣品10份混合均勻，2～8℃放置，在測定前5d、4d、2d、24h和2h分別按“2．1．3”項下方法制備供試品溶液各3份，室溫下放置，用ICP－OES法進行鋁含量測定，結果顯示5個時間點的測定結果的RSD＜6%，表明0．1mol•L－1鹽酸稀釋處理的供試品溶液在室溫放置5d內鋁含量穩定性良好，鹽酸處理2h與處理24h無顯著性差異。

2．3樣品檢測取13價肺炎球菌結合疫苗樣品3批，按“2．1．3”項下方法以0．1mol•L－1鹽酸制備供試品溶液，按照“2．1．1”項條件測得溶液中鋁含量，與化學滴定法相比較，結果均在質量標準范圍內。見表3。

3討論

肺炎球菌結合疫苗中添加了鋁離子作為佐劑提高免疫效果。根據文獻報道，分別考察了0．1mol•L－1鹽酸稀釋處理和微波消解法處理結合疫苗，結果表明此2種方法處理方法均適用于13價肺炎球菌結合疫苗鋁含量檢測，本文根據操作簡便原則選擇0．1mol•L－1鹽酸處理樣品。本文對ICP－OES法檢測鋁含量的方法學線性、重復性、回收率(準確度)、專屬性和溶液穩定性多方面進行了考察，并且確定了此方法的檢出限和定量限。結果顯示:線性良好，標準曲線r值大于0．9999;重復性RSD低于1%;回收率均在90%～110%之間;專屬性研究發現，溶液中存在鈉離子和鋰離子均不會影響13價肺炎球菌結合疫苗中鋁含量的檢測;溶液穩定性結果顯示，0．1mol•L－1鹽酸稀釋的樣品溶液鋁含量在室溫放置5d內穩定性良好。應用ICP－OES法檢測樣品鋁含量，結果顯示測定值均在理論值的85%～115%。13價肺炎球菌結合疫苗中磷酸鋁作為佐劑，確定鋁含量是控制肺炎球菌結合疫苗質量的一項重要質控指標。本試驗建立了ICP－OES法檢測13價肺炎球菌結合疫苗鋁含量的測定方法，該方法準確，重復性好，能夠取代中國藥典中規定的滴定法測定鋁含量，可為13價肺炎球菌結合疫苗的質量控制提供試驗依據和參考。

作者：陳瓊 王瑾 石繼春 王春娥 陳翠萍 葉強 單位：中國食品藥品檢定研究院