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兩棲類動物蠑螈(salamanders)和蝌蚪期爪蛙(Xenopus),可以再生多種器官和組織,包括四肢、尾、心臟、頜骨、腦及視網膜,是脊椎動物中僅有的具有較強器官再生能力的物種[1-2]。斷肢再生更是研究脊椎動物器官再生的理想模型。原因主要是,與常用的研究肢體發育的小鼠及雞胚相比,體外發育的蠑螈和爪蛙四肢的形成相對較晚,因此適合斷肢切除、組織與細胞移植等手術以及DNA電轉等實驗操作。幾百年來,兩棲動物的斷肢再生一直具有謎一樣的魅力,吸引著人們對其機制進行不懈的探索。哺乳動物包括人類是不能再生斷肢的。但無論是否具有斷肢再生能力,肢體離斷后的早期愈傷過程是相似的[1-3]。在肢體離斷后,斷端創面周圍的表皮細胞快速增殖、遷移并覆蓋于創傷表面,形成愈傷表皮(woundepidermis,WE)。愈傷表皮形成后,斷肢能否再生取決于后續是否有頂外胚層帽(apicalepidermalcap,AEC)和再生芽基(regenerationblas-tema)的形成。在具有再生能力的動物中,愈傷表皮繼續增殖增厚,形成具有多層細胞的AEC。AEC在形態和功能上類似于早期胚胎肢芽發育中的頂外胚層嵴(apicalectodermalridge,AER)[4-6]。正是在AEC所分泌的因子的影響下,斷肢殘端的組織前體細胞被調動活化,在斷肢末端集聚形成具有快速增殖能力的細胞基團,即再生芽基。再生芽基由具有特定分化潛能的前體細胞組成,與AEC之間有相互反饋與調節作用(詳見文獻[3])。而在不能再生斷肢的動物中,斷肢殘端創面愈合后不能形成AEC,也不能形成再生芽基。因此,斷肢再生是典型的依賴于芽基的割處再生(epimorphicregeneration)。再生芽基的形成機制自然是斷肢再生研究的重點內容。有趣的是,即便是在同屬于蠑螈亞目(Salaman-droidea)的兩個常用斷肢再生動物模型美西螈(墨西哥鈍口螈,ambystomamexicanum,axolotl)與東美螈(綠紅東美螈,Notophthalmusviridescens,newts)中,芽基的形成機制也不盡相同。芽基形成的物種特異性主要體現在肌肉前體細胞的來源差異上,如美西螈肌肉前體細胞主要來自于表達Pax7的肌肉干細胞—肌衛星細胞,而東美螈斷肢肌肉再生的細胞主要來自于肌纖維的去分化[7]。甚至在東美螈的幼體和成體中,肌肉的再生機制也有很大的差別:幼體斷肢肌肉再生主要依靠肌衛星細胞的活化,而成體肌肉再生則主要依賴于肌纖維的去分化[8]。因此,不同動物的斷肢再生機制存在著物種特異性。當然,不同模型動物的斷肢再生更有其共同的機制。現已證明,無論是斑馬魚、蠑螈還是哺乳動物,斷肢再生芽基并不是由多能干細胞構成,而是由不同組織前體細胞構成的。這些前體細胞擁有一定的分化潛能,但其分化潛能局限于其在肢體發育時所屬的胚層[9-11]。斷肢再生的另一個共性是神經組織對再生的重要作用[12-13]。這也是本文將主要討論的內容。有關斷肢再生中的細胞與分子機制,有興趣的讀者可以參考相關文獻[3,14-15]。

1器官再生多依賴于神經組織

研究表明,神經組織對幾乎所有已知的脊椎動物組織修復與器官再生現象都有重要作用[16-22]。哺乳動物,特別在出生前后,是擁有一定的再生能力的。例如,胚胎小鼠的表皮在創傷后可以實現無疤痕修復,但該再生現象依賴于皮膚外周神經組織[16]。出生7天內的小鼠的心肌在部分心尖切除術后可以大量進入細胞周期、增殖完成心臟再生,因此具有一定的心臟再生能力[17]。但新生小鼠的心臟再生能力在去除了支配心臟的迷走神經后則被抑制了[18]。另一個哺乳動物再生現象是指尖再生。當損傷局限在甲基質(俗稱“小太陽”)遠端時,人和小鼠的指尖是可以完全再生的。Rinkevich等[19]報導去神經后,小鼠趾尖再生會發生延遲或帶有形態缺陷。Johnston等[20]的研究亦顯示,終末分化的施旺細胞通過分泌oncostatinM及PDGF-AA來誘導再生芽基中的間充質細胞的增殖。因此,小鼠趾尖再生也是依賴神外周神經的。斑馬魚的背鰭在去神經支配后不能再生[21]。變態后的爪蛙前肢可以在截斷后長出針尖樣軟骨結構,但去神經后爪蛙前肢則愈合為鈍形殘端,不能形成針狀軟骨[22]。這些例子充分說明了神經支配對各種組織器官再生的重要性。人們對神經組織與器官再生了解最透徹的還是蠑螈的斷肢再生。

2蠑螈斷肢再生的神經依賴性

早在1823年,Todd[23]詳細報導了在蠑螈斷肢再生的不同時間節點離斷坐骨神經對再生的影響。Todd描述到,如果在蠑螈肢體離斷的同時將坐骨神經截斷,斷肢即不能再生(圖1A);如果在斷肢殘端修復后(芽基形成前或芽基早期)去除坐骨神經,則再生要么不能發生,要么會發生嚴重的延遲;若在斷肢再生已經起始或者已順利進展(芽基中后期)后分離坐骨神經,則斷肢要么發生生長停滯,要么只能再生縮小版的遠端肢體(但肢體的前后軸仍可以正常形成)。因此,Todd的實驗證明了神經對再生的重要性。但神經對斷肢再生組織的重要性在此后很長一段并沒有得到足夠的重視(詳見文獻[13])。到了1940~1950年,Singer等[24-26]通過一系列實驗詳細分析了蠑螈斷肢再生中神經組織的重要作用。Singer的一個主要發現是,斷肢再生中神經組織的類型并不重要,不管是觸覺神經還是運動神經都可以調控斷肢再生,但斷肢再生依賴于在斷肢殘端有足夠量的外周神經組織(即有一個神經閾值,nervethresh-old)。Singer[27-28]繼而提出了神經營養因子(neuro-trophicfactors)的假說來解釋神經對斷肢再生的作用(詳見后文)。然而,并不是所有的蠑螈斷肢再生情形都依賴于神經支配。1959年,Yntema[29-30]報導了肢體發育時從未受過神經支配的蠑螈肢體的斷肢再生情況。Yntema在之前已通過去除蠑螈早期神經胚的神經管并將無神經管的胚胎與正常胚胎聯和,獲得了無神經支配(aneurogenic)或者僅有很少神經支配的蠑螈肢體[31-32]。這種無神經肢體可以用來測試到底斷肢再生需要多少神經組織,以檢驗Singer提出的神經閾值(nervethreshold)理論。無神經肢體再生研究的另外一個背景是,Polezajev[33]在1939年曾報導異位移植的蝌蚪早期肢芽(無或極少神經支配)具有斷肢再生能力,提示其再生并不依賴神經的支配。利用無神經肢體模型,Yntema[29-30]發現,在肢體發育過程中未曾受到神經支配的蠑螈肢體的斷肢再生能力與正常神經支配的肢體相同,說明其斷肢再生是不需要神經的(圖1B)。Steen與Thornton[34]在1963年的實驗也支持這一點。他們將無神經支配的遠端肢體移植到正常神經支配的近端肢體形成嵌合體,然后考察斷肢再生的情況(圖1C)。結果發現,在移植后的一段時間內,當移植的供體肢體仍然處于無神經支配的狀態時,斷肢再生可以正常進行。然而,由于蠑螈能夠再生肢體神經,受體蠑螈的肢神經(臂叢神經或坐骨神經)可以長入遠端無神經肢體,對其進行神經支配。而這時候被重新支配的遠端肢體的再生則依賴于神經組織的存在了,因為如果此時對嵌合的肢體去神經的話,斷肢則不再生。有意思的是,再次處于無神經支配狀態較長時間后,移植的遠端肢體的斷肢再生則部分擺脫了神經組織的控制。因此,斷肢再生是否依賴神經組織與肢體是否曾受神經支配有關;一旦肢體被神經支配過,則其再生即依賴于神經組織了。而長期處于無神經支配狀態的肢體的斷肢再生則“擺脫”了對神經支配的依賴性。由于此現象類似于藥物成癮,因此,我們稱之為斷肢再生的“神經成癮性依賴”。

3斷肢再生中神經的作用

如前所述,Singer[27-28]認為,斷肢末端的外周神經組織通過分泌某種或某些神經營養因子(neuro-trophicfactors),促進芽基細胞的增殖。因此,這些因子具有絲裂原(mitogen)特征。如前所述,斷肢再生依賴于AEC與再生芽基的形成及其相互作用[3]。大量實驗表明,神經組織在斷肢再生中的作用靶組織主要是再生芽基。首先,如果在芽基形成后將斷肢神經組織去除,則會導致芽基細胞有絲分裂的停滯[35]。體外培養的斷肢芽基細胞只有在神經組織存在時才能有效地增殖[36]。這說明,神經組織及其產生的因子是芽基細胞增殖所必需的。其次,如果在去神經的蠑螈斷肢殘端人為的添加外源(健康)神經組織,則可以有效地拯救再生芽基的生長[37]。最近,Satoh等[38]通過將爪蛙幼體的坐骨神經牽引到前肢,做成超神經支配的模型然后研究前肢再生的情形,發現超神經支配的爪蛙前肢的軟骨生成得到了促進。這些證據都說明,再生芽基是神經支配的靶組織。神經組織對AEC的作用則沒有這么清晰。一方面,雖然在創傷表皮中有大量的觸覺神經纖維,AEC的形成對神經支配的依賴性卻沒有再生芽基對神經支配的依賴性強烈。研究顯示,去掉感覺神經并不影響AEC形成[39-40]。這可能與AEC的細胞來源相關。愈傷表皮(及AEC)細胞主要來自于斷肢殘端的上皮細胞的遷移及(一定量的)擴增,而再生芽基的形成需要前體細胞的大量擴增。另一方面,一些在愈傷表皮中上調的基因如dlx3(distal-lesshomeobox3)及sp9(sp9transcriptionfactor)的表達則在去神經后受到抑制[41-42],AEC產生與分泌絲裂原的能力也受到去神經的影響[3]。因此,AEC可能間接受神經組織的調控。鑒于AEC與再生芽基的相互作用對斷肢再生的重要性,我們認為,AEC至少在功能上是依賴于神經支配的,也是神經的靶組織。此外,外周神經組織還調節了斷肢新生血管的形成[43]。盡管早期再生芽基的形成不依賴于大量的血供,中后期再生芽基的持續生長與進一步分化則依賴新生血管的生成。因此,神經組織對斷肢再生的調控可通過作用于多個靶組織來進行。外周神經組織分泌產生的神經營養因子對這些靶組織起了正調節的作用。這也是目前斷肢再生中受到研究者青睞的觀點。從另外一個角度來看,斷肢再生對神經的依賴亦可能是由于去神經導致的斷肢的微環境發生了不利于再生的改變。在研究去神經對斷肢再生的影響時,幾乎所有去神經都是通過顯微手術操作來實現的。因此,術后在斷肢中仍不可避免地存留了一些神經組織,而這些受損的、不健康的神經組織會引起炎癥反應,繼而抑制再生。如Tassava及其同事[44-45]將軸突切除的外圍神經移植到斷肢后導致再生芽基生長變緩,在無神經肢體(可再生)中種植受破損的外圍神經組織則會導致再生芽基不能形成。這些結果說明,損傷(病理狀態的)的外周神經組織會產生抑制再生的因子,是(病理性)神經組織對斷肢再生的負向調控。

4斷肢再生神經因子

Singer[27-28]對斷肢再生神經依賴性解釋的核心是神經營養因子(neurotrophicfactorXs)介導了神經組織的作用。尋找斷肢再生中的神經營養因子有助于理解神經與再生芽基及AEC相互作用的分子機制。神經營養因子必須滿足一些基本要求[3]。首先,該因子在再生芽基表達且其表達受神經組織的調控。其次,神經因子必須能夠促進芽基細胞的增殖(如體外培養芽基細胞的有絲分裂),或促進體內芽基組織的生長。最后,神經因子應能拯救去神經斷肢再生。目前,人們已發現了一些因子可能介導了斷肢再生過程中的神經的作用。這些候選因子包括P物質(substanceP)、胰島素(insulin)、轉鐵蛋白(transferin)、神經生長因子(nervegrowthfactor)、纖維母細胞生長因子(fibroblastgrowthfactor,Fgf)加上成骨生長因子(bonemorphogenesisfactor)如(Fgf8+Bmp7)(這些因子的具體作用可參見文獻[13])。本文以最近發現的蠑螈前梯度蛋白(newtantigengradi-ent,nAG)[46]及神經調節蛋白(neuregulin,Nrg)[46]為例說明神經營養因子的特性。Brockes實驗室長期致力于解釋神經調控蠑螈斷肢再生機理。他們在2007年報導了東美蠑螈中前梯度蛋白nAG是一個調控斷肢再生的關鍵神經因子[46]。蠑螈肢體離斷后,神經軸突先是發生退縮,然后會沿著殘留神經鞘膜向斷肢殘端生長,而nAG則表達于神經鞘膜的施旺細胞中。此后,nAG在創傷表皮腺體細胞中表達,且是芽基細胞持續增殖所必需的。去神經后,nAG則不能表達。在去神經的斷肢中通過電轉質粒過表達nAG則可以拯救斷肢再生。nAG亦能促體外培養的肢芽細胞的增殖。因此,nAG滿足神經因子的必要條件。Brockes早期的工作還提示神經調節蛋白1(neu-regulin1,Nrg1)是潛在的神經營養因子[48]。此后,Monaghan實驗室[47]在美西螈的斷肢再生中闡述了Nrg1介導神經調控斷肢再生的機制。Nrg1在美西螈斷肢再生芽基組織中有較高的表達,并表達于外周神經及背跟神經節(圖2A和圖2B)。Nrg1表達量在去神經后的肢體末端被顯著下調。而種植Nrg1的蛋白珠則可以拯救去神經的斷肢再生(圖2C~圖2E)。因此,Nrg1是美西螈斷肢再生中的神經營養因子。除了斷肢再生,在其他動物模型中的實驗亦提示,Nrg1可作用于多種組織修復過程。Nrg1可以促進外圍神經組織再生外[49],Nrg1也可以促進斑馬魚和新生小鼠心肌細胞的增殖[50-51],而且可以拯救去神經小鼠心臟的心肌細胞增殖[18]。遺憾的是,由于蠑螈的基因組直到最近才完成[52-53],因此,對于nAG和Nrg1的研究并沒有在基因敲除的基礎上進行。nAG或其同源物在其他斷肢再生模型,如爪蛙斷肢再生中是否起了類似作用也有待于驗證。此外,現有候選神經因子間的相互作用及調控關系也是一個需要探討的問題。Stocum[54]曾提出假設認為,Fgf2與nAG可能在促進芽基細胞增殖方面有協同作用。但目前尚沒有證據表明,現有候選神經因子之間存在上下游調控機制,這些因子也并不集中于某種信號通路。因此,研究者對神經營養因子的尋找仍在繼續。

5爪蛙斷肢再生的神經依賴性

作為經典發育生物學模型的爪蛙也是研究再生的常用模型[55]。與蠑螈不同的是,爪蛙的斷肢再生能力隨著肢體的發育分化而減弱直至喪失,因此有其特異性[56]。爪蛙斷肢再生對神經支配的依賴性也是逐漸建立起來的,早期(NieuwkoopFaber,NFstage51-52)蝌蚪斷肢再生不依賴于外周神經,而晚期蝌蚪斷肢再生則依賴于神經[33,57-58]。變態后的爪蛙斷肢可以形成纖維樣芽基,完成劍穗狀軟骨再生,但去神經后的爪蛙斷肢則不能形成芽基[22](圖3)。先前的研究認為,由于早期蝌蚪肢芽組織中存在較大量的絲裂原因子,如大量成纖維細胞生長因子2(Fgf2),因此其斷肢再生不依賴于神經[59-60]。而我們最近的實驗證明,早期蝌蚪(NFstage53)的后肢在脊髓損傷后是不能再生的,說明爪蛙蝌蚪的斷肢再生也是依賴于神經支配的[61]。我們通過對早期蝌蚪(NFstage53)的脊髓在較高位(III-V胸椎)離斷以實現早期蝌蚪后肢的去神經。而早前的工作中,Filoni與Paglialunga采用的是通過離斷8-9-10脊神經及相應神經節及與其相連的一段脊神經來實現蝌蚪后肢的去神經的[57]。我們的觀察提示,來自于更高位的脊髓中樞神經系統的信號調控了蝌蚪早期斷肢再生。

6爪蛙蝌蚪斷肢再生中的中樞神經調控

如我們一開始提到的,近年來人們對于脊椎動物斷肢再生的細胞與分子機制有了較為深入的了解。但當前研究主要側重于斷肢局部機制(如細胞來源),對再生的神經依賴機理的研究亦集中于外周神經組織,而對中樞神經系統調控斷肢再生則缺少必要的重視。早期研究表明,盡管處于饑餓狀態的蠑螈仍然可以很好地再生斷肢,但當蠑螈的腦垂體受損后,其斷肢的再生芽基要比一般再生芽基小得多,說明激素及營養對斷肢再生有作用[62]。我們實驗室最近對黑皮質素系統調控斷肢再生的研究則進一步揭示中樞神經系統對斷肢有著重要的影響[61]。下丘腦黑皮質素系統主要調控動物的進食行為及能量平衡。黑皮質素系統主要包括阿黑皮質素原(pro-opiomelanocortin,POMC)、神經肽Y(neuropeptideY,NPY)、黑皮質素受體(melanocor-tinreceptors,MCRs)以及Agouti和Agouti相關蛋白(Agoutirelatedprotein,AgRP)[63-65]。哺乳動物中阿黑皮質素原(POMC)主要在垂體前葉和中葉、下丘腦弓形核(hypothalamusarcuatenucleus)中表達。黑皮質素在中樞神經系統及外周組織中均有生物學活性,而其活性與所在位置及特異的黑皮質素受體(MCRs)緊密相關[66-67]。黑皮質素受體(MCRs)在不同組織中存在不同的生理學功能。在能量平衡調控中起作用的主要是黑皮質素受體-3(Mc3r)及黑皮質素受體-4(Mc4r)。為了研究下丘腦黑皮質素系統對斷肢再生的影響,我們以電烙損傷術對早期蝌蚪(NFstage53)的下丘腦進行了損傷,發現下丘腦受損的蝌蚪斷肢再生受到了抑制[61]。下丘腦損傷會下調肢體組織中的促黑素(α-melanocytestimulatinghormorne,α-MSH,POMC前體多肽衍生物)的表達。MCR中僅有Mc4r在蝌蚪斷肢再生中有顯著表達。Mc4r在肢體中的表達與神經組織緊密相連,而且受神經支配的影響。在脊髓損傷的蝌蚪斷肢里,α-MSH和Mc4r的表達均被下調,提示α-MSH/Mc4r通路可能具有神經營養因子的作用[61]。的確,在去神經的早期蝌蚪后肢或爪蛙幼體前肢斷端種植浸泡了α-MSH的蛋白珠可以有效地拯救去神經導致的斷肢再生缺陷[61]。因此,我們的結果提示,α-MSH/Mc4r通路至少可以替代神經組織調控爪蛙的斷肢再生。α-MSH的神經營養因子作用在其他實驗體系亦有報導。如Plantinga等[68]發現,當外周神經受損后,α-MSH能夠促進神經的再生,同時Mc4r在脊髓和背根神經節有著很高的表達量。此外有研究顯示,當坐骨神經或脊髓受到損傷后,外周的Mc4r表達量會發生顯著變化[69]。在小鼠胚胎肢體發育中,Mc4r與α-MSH亦在肢體神經中表達[61],說明其在肢體發育與再生中的功能與神經支配是相關的。盡管我們尚不完全清楚下丘腦對斷肢再生是如何調控的,我們的研究表明,過氧化物(reactiveoxygenspecies,ROS)可能介導了這一過程。近年來有學者提出,過氧化物的代謝平衡與斷肢再生的神經依賴性有關[70]。我們也發現,在去神經或敲降Mc4r后,蝌蚪后肢細胞中過氧化物的總量被下調了。而通過調節過氧化物產生或種植α-MSH的蛋白珠可以提高過氧化物產量,繼而拯救斷肢再生[61]。盡管Mc4與現有候選神經因子之間的關系需要進一步的研究,我們的研究結果將Mc4r通路、過氧化物與斷肢再生的神經支配聯系在了一起。因此,除了外圍神經組織,中樞神經系統也調控了爪蛙的斷肢再生。

7結語

現有的研究表明,神經組織對器官穩態維持、組織修復及器官再生均有重要的調節作用。斷肢再生依賴于足夠量的外周神經組織的存在,其作用可能是為了確保再生的遠端肢體能夠有效地與近端肢體有機地整合。已有一些因子如nAG、Nrg1、α-MSH可能介導了神經對斷肢再生的調控,但目前我們對于神經與再生芽基之間是如何進行信息交流與相互調節的以及中樞神經系統如何調控斷肢再生的了解還遠遠不夠。鑒于蠑螈及爪蛙在基因組學及基因編輯方面的最新進展[52-53,71-73],我們相信,兩棲動物作為唯一能夠完整再生斷肢的脊椎動物模型,將更加值得生物學研究者的重視。

作者：林古法;陳瑛 單位：同濟大學附屬東方醫院轉化醫學研究中心