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《中國病理生理雜志》2016年第四期

［摘要］

目的:研究鈣庫操縱性鈣通道(store-operatedcalciumchannels，SOCC)相關(guān)功能蛋白ORAI1-3和STIM1-2在人循環(huán)纖維細(xì)胞中的表達(dá)及SOCC對人循環(huán)纖維細(xì)胞分化的影響。方法:采集健康人外周靜脈血，分離出單個核細(xì)胞，體外培養(yǎng)分化為循環(huán)纖維細(xì)胞。采用RT-PCR和real-timePCR檢測循環(huán)纖維細(xì)胞中ORAI1-3及STIM1-2的mRNA表達(dá)情況，并檢測SOCC抑制劑對循環(huán)纖維細(xì)胞分化的影響。結(jié)果:Real-timePCR檢測結(jié)果顯示ORAI1-3和STIM1-2mRNA在循環(huán)纖維細(xì)胞中有較高的表達(dá)水平，并且SOCC抑制劑SKF-96365對循環(huán)纖維細(xì)胞分化具有明顯的抑制作用。結(jié)論:SOCC表達(dá)于循環(huán)纖維細(xì)胞中，并且影響循環(huán)纖維細(xì)胞的分化。

［關(guān)鍵詞］

循環(huán)纖維細(xì)胞;鈣庫操縱性鈣通道;ORAI1-3;STIM1-2

人循環(huán)纖維細(xì)胞是外周循環(huán)中的一種骨髓來源的間充質(zhì)祖細(xì)胞［1］，由CD14+單核細(xì)胞分化而來［2］，主要參與組織的修復(fù)與纖維化的過程，除此之外，還能作為抗原遞呈細(xì)胞激活T淋巴細(xì)胞［3］、促進(jìn)血管生成［4］和穩(wěn)定細(xì)胞外基質(zhì)［5］。在健康個體中，它占有核細(xì)胞的比例不到1%［6］。近年來，大量研究證實循環(huán)纖維細(xì)胞是肌成纖維細(xì)胞的前體［7］，能夠遷移并在肺中募集，可能通過促進(jìn)平滑肌層增厚［8］、促纖維化和/或促進(jìn)炎癥過程［3］、促進(jìn)新血管生成［4］和重建細(xì)胞外基質(zhì)［5］等途徑參與慢性哮喘氣道重塑過程。鈣信號是細(xì)胞的重要第二信使，參與了細(xì)胞的增殖、分化、遷移和細(xì)胞因子分泌等多種功能的調(diào)控。細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度升高主要通過肌漿網(wǎng)/內(nèi)質(zhì)網(wǎng)等鈣庫中的內(nèi)鈣釋放和胞外鈣離子內(nèi)流兩種途徑實現(xiàn)［9］。細(xì)胞膜上鈣庫操縱性鈣通道介導(dǎo)的鈣庫操縱性鈣內(nèi)流是非興奮性細(xì)胞外鈣內(nèi)流的主要途徑［10］。目前發(fā)現(xiàn)ORAI家族蛋白ORAI1-3主要參與SOCC的鈣內(nèi)流孔道的構(gòu)成，而STIM家族蛋白STIM1-2主要作為胞內(nèi)鈣庫鈣離子濃度的“傳感器”，在鈣離子濃度下降時將這一信號傳遞到胞膜的SOCC，促使其開放，介導(dǎo)鈣離子內(nèi)流。本研究應(yīng)用real-timePCR檢測了體外培養(yǎng)的人循環(huán)纖維細(xì)胞中SOCC相關(guān)功能蛋白ORAI1-3和STIM1-2表達(dá)情況，并初步探討SOCC抑制劑對循環(huán)纖維細(xì)胞分化成熟的影響，為將來深入探討它們在支氣管哮喘病理機(jī)制中的功能奠定基礎(chǔ)。

一、材料和方法

1主要試劑RPMI-1640培養(yǎng)基、1mmol/LHEPES、100×非必須氨基酸、100mmol/L丙酮酸鈉和100×ITS-3均購自Sigma;青霉素(1×107U/L)/鏈霉素(10g/L)混合液(100×)和200mmol/L谷氨酰胺購自Hy-Clone;平底24孔組織培養(yǎng)板購自BDBiosciences;人CD14+單核細(xì)胞負(fù)選磁珠購自DynalBiotech;TRITC連接的鼠抗人CD45和I型膠原(collagenⅠ，ColⅠ)抗體、驢抗兔IgGH＆L(FITC)II抗及SKF-96365購自Abcam;TRIzol、DNA處理酶I和逆轉(zhuǎn)錄酶SSⅢ購自Invitrogen;高保真Taq酶和SYBRPremixExTaqTM購自TaKaRa。所有引物由生工生物工程(上海)股份有限公司根據(jù)設(shè)計合成。

2主要方法

2.1人循環(huán)纖維細(xì)胞的分離及培養(yǎng)用肝素抗凝管采集每位健康志愿者(來自武漢大學(xué)醫(yī)學(xué)院，均簽署書面知情同意書)外周血50mL，用pH7.4無菌磷酸鹽緩沖液(PBS)等體積稀釋后，用等體積的淋巴細(xì)胞分離液分離，2000r/min離心20min，小心吸取白膜。用至少3倍體積的無菌PBS洗滌白膜，1500r/min離心15min，輕輕吸除上清。分離所得的細(xì)胞即為外周血單個核細(xì)胞。加500μL隔離緩沖液(0.1%BSA和2mmol/LEDTA的無Ca2+及Mg2+的PBS)輕輕混勻細(xì)胞，用DynabeadsUntouchedTM人單核細(xì)胞磁珠負(fù)選試劑盒得CD14+單核細(xì)胞。用無血清的RPMI-1640完全培養(yǎng)基［含10mmol/LHEPES，2mmol/L谷氨酰胺，1×105U/L青霉素，100mg/L鏈霉素，0.2%BSA，1×ITS-3(5mg/L胰島素，5mg/L轉(zhuǎn)鐵蛋白，5μg/L亞硒酸鈉)，1mmol/L丙酮酸鈉，1×非必需氨基酸］1mL重懸細(xì)胞，吹打混勻。將所得的細(xì)胞按2.5×109/L的密度接種于24孔培養(yǎng)板內(nèi)，每孔2mL，然后將培養(yǎng)板置于含5%CO2的細(xì)胞培養(yǎng)箱內(nèi)37℃培養(yǎng)7d，觀察細(xì)胞形態(tài)變化。

2.2人循環(huán)纖維細(xì)胞的鑒定(1)形態(tài)學(xué)鑒定:按上述方法培養(yǎng)7d后，光鏡下觀察，呈紡錘狀的長梭形貼壁細(xì)胞即為循環(huán)纖維細(xì)胞。(2)免疫組織化學(xué)鑒定:將分離的細(xì)胞接種于共聚焦培養(yǎng)皿內(nèi)，置于37℃，含5%CO2的細(xì)胞培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)7d，然后選擇分化較好的細(xì)胞培養(yǎng)皿，棄培養(yǎng)基，PBS洗滌細(xì)胞3次，加入TRITC連接的CD45抗體，4℃孵育30min后，細(xì)胞清洗3次。用250μL的固定破膜劑重懸細(xì)胞，4℃固定破膜20min。加入PBS溶液2mL，輕輕晃動培養(yǎng)皿，洗滌細(xì)胞3次，用含2%牛血清白蛋白的PBS室溫封閉60min。加ColⅠ的I抗，4℃過夜。再用2mLPBS清洗細(xì)胞3次后，加入FITC標(biāo)記的驢抗兔IgG的II抗，4℃暗室孵育，過夜。2mLPBS清洗細(xì)胞3次后，加入PBS，熒光顯微鏡下觀察CD45和ColI的表達(dá)情況。

2.3RT-PCR及Real-timePCR檢測循環(huán)纖維細(xì)胞中ORAI1-3及STIM1-2的mRNA表達(dá)情況將分離得到的CD14+單核細(xì)胞按2.5×108/L的密度接種到24孔培養(yǎng)板培養(yǎng)7d。取樣后每管加入1mLTRIzol進(jìn)行RNA抽提，最后每管RNA晾干后加40μL滅菌0.1‰DEPC處理雙蒸水溶解RNA沉淀。取2μg總RNA至1.5mL離心管中進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，所使用DNaseI和逆轉(zhuǎn)錄酶SSⅢ均來自Invitrogen，反轉(zhuǎn)錄完成后生產(chǎn)的cDNA產(chǎn)物補(bǔ)雙蒸水至50μL。RT-PCR檢測采用的反應(yīng)體系為:0.4μLprimerF/R(10μmol/L)，2μLdNTPs(2.5mmol/L)，2μL10倍緩沖液，0.2μLExTaq，2μL反轉(zhuǎn)錄cDNA產(chǎn)物為模板，最后補(bǔ)滅菌雙蒸水至20μL;反應(yīng)條件為:為94°C5min;94°C15s，60°C30s，72°C30s，共28循環(huán);72°C5min。反應(yīng)完成后PCR產(chǎn)物經(jīng)0.8%瓊脂糖凝膠電泳檢測。Real-timePCR檢測基因表達(dá)量采用的反應(yīng)體系是10μLSYBRPremixExTaqTM，0.4μLprimerF/R(10μmol/L)，0.4μLROXReferenceDyeⅡ(10μmol/L)，2μL反轉(zhuǎn)錄cDNA產(chǎn)物，最后補(bǔ)滅菌雙蒸水至20μL。Real-timePCR反應(yīng)程序為:94°C10s;94°C5s，60°C38s，40循環(huán);95℃15s，60℃1min，95℃15s，60℃15s。RT-PCR以及real-timePCR所用引物見表1。

2.4SOCC抑制劑對循環(huán)纖維細(xì)胞分化的影響將分離得到的PBMCs按2.5×108/L的密度接種到24孔板內(nèi);分組情況如下:分別設(shè)置空白對照組和SOCC抑制劑SKF-96365干預(yù)組:選擇1μmol/L、3μmol/L、10μmol/L、30μmol/L和100μmol/L多個濃度梯度;37℃培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)7d，然后于10倍光學(xué)顯微鏡下觀察循環(huán)纖維細(xì)胞分化的情況，隨機(jī)取5個視野拍照，并進(jìn)行細(xì)胞計數(shù)。

3統(tǒng)計學(xué)處理本實驗中所有數(shù)據(jù)均在Excel中完成分析，數(shù)值計量資料均以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(mean±SD)表示，兩組間差異比較采用獨立樣本t檢驗，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

二、結(jié)果

1循環(huán)纖維細(xì)胞的鑒定將分離所得PBMCs用無血清培養(yǎng)基培養(yǎng)7d后，光鏡下可見部分貼壁細(xì)胞分化為長梭形，形態(tài)上符合已分化的循環(huán)纖維細(xì)胞的特征(圖1)，與文獻(xiàn)報道一致［11］;免疫組織化學(xué)檢測細(xì)胞分子標(biāo)記的表達(dá)情況，冰丙酮固定細(xì)胞并破膜后，用TRITC連接的CD45抗體和FITC連接的ColI抗體對細(xì)胞進(jìn)行染色，經(jīng)生物素親和素的信號放大作用，熒光顯微鏡下可同時觀察到TRITC的紅色熒光和FITC的綠色熒光，證實梭形細(xì)胞能夠同時表達(dá)CD45和ColI分子。

2RT-PCR和real-timePCR檢測循環(huán)纖維細(xì)胞中ORAI1-3和STIM1-2的mRNA表達(dá)RT-PCR結(jié)果顯示各基因引物特異性良好，條帶特異且PCR產(chǎn)物大小符合預(yù)期，同時也表明了這批引物能夠用于real-timePCR檢測，凝膠電泳檢測結(jié)果見圖3。進(jìn)一步使用這些引物我們在6個志愿者的人體循環(huán)纖維細(xì)胞中對ORAI1、ORAI2、ORAI3、STIM1和STIM2進(jìn)行了real-timePCR的檢測。結(jié)果顯示，ORAI1mRNA的表達(dá)量明顯高于ORAI2和ORAI3;而STIM1mRNA的表達(dá)量也高于STIM2，表明ORAI1和STIM1是循環(huán)纖維細(xì)胞SOCC的主要構(gòu)成和調(diào)節(jié)分子，見圖4。

3SOCC抑制劑SKF-96365對循環(huán)纖維細(xì)胞分化的影響SKF-96365是SOCC的非特異性抑制劑，研究表明在SKF濃度為10μmol/L時，基本上對細(xì)胞無毒害作用［12］。如圖5所示，無血清培養(yǎng)基培養(yǎng)的PBMCs在加入較低濃度(1μmol/L和3μmol/L)的SKF-96365時，循環(huán)纖維細(xì)胞的分化過程即受到明顯的抑制，且具有很強(qiáng)的濃度依賴性，即濃度越高抑制越明顯。當(dāng)SKF-96365的濃度為10μmol/L時，能抑制大部分循環(huán)纖維細(xì)胞的分化。

三、討論

氣道重塑是慢性哮喘的重要特征，其病理改變包括氣道上皮下纖維化及肌成纖維細(xì)胞聚積［13］。許多研究都表明循環(huán)纖維細(xì)胞是參與哮喘結(jié)構(gòu)和功能損害的重要因素。最早在2003年Schmidt等［14］發(fā)現(xiàn)在哮喘患者的氣道中含有循環(huán)纖維細(xì)胞(CD45+/CD34+和ColI為識別標(biāo)記)，而且這些細(xì)胞隨著患者接觸過敏原增多而數(shù)量增多。一項獨立研究發(fā)現(xiàn)嚴(yán)重難治性哮喘患者的支氣管活檢樣本中支氣管壁中循環(huán)纖維細(xì)胞數(shù)量較正常組明顯升高，而外周血中的循環(huán)纖維細(xì)胞數(shù)量也明顯升高［8］。最近一項臨床研究也發(fā)現(xiàn)哮喘患者外周血中的循環(huán)纖維細(xì)胞數(shù)量與哮喘的嚴(yán)重程度呈正相關(guān)，可以作為臨床嚴(yán)重哮喘的生物學(xué)標(biāo)志［15］。SOCC是非興奮性細(xì)胞胞外Ca2+內(nèi)流的主要通道，參與了基因轉(zhuǎn)錄、細(xì)胞凋亡、肌肉收縮、炎癥和應(yīng)激等多種生理和病理生理過程。有研究表明ORAI1和STIM1兩種蛋白是構(gòu)成SOCE通道的重要組成部分。ORAI是近年來發(fā)現(xiàn)的一種位于細(xì)胞膜上的4次跨膜離子通道蛋白，哺乳動物ORAI家族中有3個成員:ORAI1、ORAI2和ORAI3，其中ORAI1是最重要的SOCE的效應(yīng)蛋白。研究表明ORAI1可以和ORAI2、ORAI3復(fù)合體來介導(dǎo)SOCE［16］。STIM家族成員包括STIM1和STIM2。在哺乳動物研究中發(fā)現(xiàn)STIM1是SOCC的重要調(diào)節(jié)分子，而STIM2主要與維持鈣庫的穩(wěn)定有關(guān)。STIM1是分子量為77kD的跨膜蛋白，主要位于ER膜上，它具有感受鈣池充盈狀態(tài)并將感受信號通過不同蛋白作用機(jī)制傳遞給ORAI及TRPC通道的雙重功能，是共同介導(dǎo)SOCE的關(guān)鍵分子［17］。我們的mRNA表達(dá)研究表明，體外培養(yǎng)的循環(huán)纖維細(xì)胞均表達(dá)這些SOCC相關(guān)蛋白，其中以STIM1和ORAI1的表達(dá)最為豐富，提示STIM1和ORAI1是循環(huán)纖維細(xì)胞SOCC的主要構(gòu)成分子和調(diào)節(jié)分子。

單核細(xì)胞是循環(huán)纖維細(xì)胞的前體，SOCC介導(dǎo)的鈣離子內(nèi)流參與單核細(xì)胞的激活、增殖、分化及細(xì)胞因子的分泌等多種生理過程［18］。我們的既往研究顯示，在單核細(xì)胞分化而來的巨噬細(xì)胞和樹突狀細(xì)胞［12，19］，SOCC發(fā)揮了重要功能，對樹突狀細(xì)胞的成熟和抗原遞呈等功能具有調(diào)節(jié)作用，并有可能參與哮喘氣道炎癥過程。循環(huán)纖維細(xì)胞同樣由單核細(xì)胞分化而來，因此，理論上SOCC同樣會發(fā)揮功能調(diào)控作用。我們的研究結(jié)果證實了SOCC調(diào)控循環(huán)纖維細(xì)胞的分化過程。成纖維細(xì)胞和肌成纖維細(xì)胞可由循環(huán)纖維細(xì)胞分化而來，其基因表達(dá)和炎癥介質(zhì)釋放等多種細(xì)胞功能調(diào)控與非選擇性的SOCC密切相關(guān)［20-21］。因此，循環(huán)纖維細(xì)胞的分化以及其進(jìn)一步的分化為成纖維細(xì)胞和肌成纖維細(xì)胞的過程均受到SOCC的影響，提示SOCC可以作為一個節(jié)點分子，調(diào)節(jié)循環(huán)纖維細(xì)胞參與的病理生理過程，比如慢性哮喘的氣道重塑過程。下一步我們將用體內(nèi)實驗進(jìn)一步驗證SOCC抑制后對循環(huán)纖維細(xì)胞在慢性哮喘氣道重塑中的作用的影響。本實驗結(jié)果顯示循環(huán)纖維細(xì)胞表達(dá)SOCC相關(guān)基因，并且SOCC的活性影響循環(huán)纖維細(xì)胞的分化，表明SOCC是循環(huán)纖維細(xì)胞功能的重要調(diào)節(jié)機(jī)制。

作者：鐘金男 蘭蘭 何光珍 黃革 楊炯 高亞東 單位：武漢大學(xué)中南醫(yī)院呼吸內(nèi)科