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《中國病理生理雜志》2016年第四期

［摘要］

目的:研究白楊素(chrysin)對離體大鼠主動脈肌源性反應的影響，并探討其作用機制。方法:分離SD大鼠主動脈，采用離體血管環灌流裝置觀察chrysin對血管環的基礎張力及對60mmol/LKCl預收縮血管的舒張作用，并結合不同抑制劑處理，探討其作用于血管環的可能機制。結果:Chrysin(10－6mol/L、3×10－6mol/L、10－5mol/L、3×10－5mol/L和10－4mol/L)對基礎狀態血管無明顯影響，但對60mmol/LKCl預收縮的血管環具有濃度依賴性舒張作用，并且去內皮組舒張作用弱于內皮完整組(P＜0.05)。NOS抑制劑L-NAME(10－4mol/L)處理血管后，chrysin的舒張血管作用部分被抑制(P＜0.05)，COX抑制劑吲哚美辛(10－5mol/L)處理血管后無明顯抑制作用。鉀通道阻滯劑4-氨基吡啶(10－3mol/L)、氯化鋇(10－4mol/L)、格列苯脲(10－5mol/L)和四乙胺(10－3mol/L)預孵后，chrysin舒張血管作用均被部分抑制(P＜0.05)。Chrysin(10－6mol/L、10－5mol/L和10－4mol/L)可濃度依賴性抑制2．5mmol/LCaCl2引起的主動脈收縮。結論:Chrysin能夠濃度依賴性舒張大鼠主動脈，其作用機制可能與促進一氧化氮釋放、激活4種K+通道及減少細胞內鈣離子濃度有關。

［關鍵詞］

白楊素;主動脈環;一氧化氮合酶;環氧合酶;鉀通道;鈣

白楊素(chrysin)是從紫葳科植物木蝴蝶中提取的一種天然食源性黃酮，廣泛存在于多種植物、蜂蜜和蜂膠中［1-3］。Chrysin具有廣泛的藥理學作用，包括抗病毒［4］、抗高血糖［5］、抗高血壓［6］、抗腫瘤［7］、抗糖尿病腎?。?］等，是合成抗癌、抗菌、防治心腦血管疾病、降血脂、消炎等藥物的原料。血管疾病是目前影響人類健康的主要疾病之一，導致血管產生疾病的原因多樣，其中大部分是由于病變使管腔狹窄，繼而發生受供器官或肢體的缺血以至壞死。大量臨床資料表明，chrysin對動脈粥樣硬化、高血壓等血管疾病有治療作用［5-6，9］，但其具體作用機制尚不明確。本實驗利用離體器官恒溫灌流系統，觀察chrysin對大鼠離體主動脈環靜息張力及對氯化鉀(KCl，60mmol/L)預收縮血管的舒張作用，同時，通過研究chrysin對去內皮、一氧化氮合酶(nitricoxidesyn-thase，NOS)抑制劑、環氧合酶(cyclooxygenase，COX)抑制劑、鉀離子通道抑制劑等引起的血管收縮作用的影響，進一步探討其舒張血管作用的可能機制，為chrysin的臨床應用及進一步研究、利用及開發新藥提供理論依據。

一、材料和方法

1實驗動物Sprague-Dawley成年雄性大鼠，體重200～240g，由山西醫科大學實驗動物中心提供，許可證號為SCXK(晉)2009-0001。動物飼養環境溫度為22～23℃，濕度50%～55%，自由攝食飲水。

2主要試劑乙酰膽堿(acetylcholine，ACh)、苯腎上腺素(phenylephrine，PE)、氯化鋇(BaCl2)、四乙胺(tetra-ethylammonium，TEA)、4-氨基吡啶(4-aminopyridine，4-AP)、格列本脲(glibenclamide，Gli)、左旋硝基精氨酸甲酯(L-nitroarginiemethylester，L-NAME)、吲哚美辛(indometacin，Indo)、二甲基亞砜(dimethylsulpho-xide，DMSO)和HEPES均購自Sigma;白楊素購自大連美侖生物;其余試劑均為分析純，購自武漢博士德公司。

3實驗儀器PowerLab生物信號采集分析系統、DMT張力記錄儀(澳大利亞埃德公司);HSS-1B數字式超級恒溫泵(成都儀器廠);微量加樣器(上海求精生化試劑儀器有限公司);精密天平(北京賽多利斯儀器有限公司);PHS-3C精密pH計(上海雷磁);Sartorius-BS124S精密天平(北京賽多利斯)。

4主要方法

4．1血管環的制備大鼠斷頭處死后，立刻取其主動脈，置于4℃100%O2飽和的PSS液中，PSS液具體成分為:NaCl144mmol/L，KCl5.8mmol/L，CaCl22.5mmol/L，MgCl24.2mmol/L，Glucose11.1mmol/L，HEPES5mmol/L，pH7.4。去除離體主動脈周圍結締組織及脂肪后，剪成長度3mm～4mm的血管環。主動脈環隨機分為去內皮組和內皮完整組，去內皮組采用與血管內徑相適的棉棒去除其內壁的內皮細胞，內皮完整組不做處理。將制備好的主動脈環用2根不銹鋼微型掛鉤貫穿血管管腔，將離體主動脈水平懸掛在10mL浴漕內，下方固定，上方以一細鋼絲連于張力換能器。Powerlab生物信號測定系統記錄血管張力變化。浴管內持續通以100%O2、37℃的PSS液5mL。調整基礎張力至2g，平衡1h，每15min換1次PSS溶液。

4．2血管內皮功能檢測所有血管環用60mmol/LKCl進行刺激，待其穩定后，即連續2次刺激所引起的收縮幅度差別小于5%，用PE(10－6mol/L)預收縮，收縮平穩后加入10－5mol/L的Ach，舒張幅度不超過收縮幅度的5%時，認為內皮去除完全［10］。

4．3Chrysin對大鼠主動脈環基礎張力的影響待血管環穩定后，按照濃度累加法加入chrysin(10－7mol/L、10－6mol/L、10－5mol/L、10－4mol/L和10－3mol/L)或等量的PSS液，觀察不同濃度的chrysin對大鼠主動脈血管環基礎張力的影響。

4．4Chrysin對KCl預收縮的內皮完整組和去內皮組血管環的影響血管環穩定后，內皮完整組和去內皮組加入60mmol/LKCl，收縮達坪值后，分別累積加入chrysin(10－6mol/L、3×10－6mol/L、10－5mol/L、3×10－5mol/L和10－4mol/L)，對照組加入相同劑量的PSS液。以60mmol/LKCl誘發的主動脈環最大收縮幅度作為100%，計算在加入不同濃度chrysin后舒張百分比變化，建立濃度效應曲線。

4．5L-NAME和Indo對chrysin舒張作用的影響用L-NAME(10－4mol/L)或Indo(10－5mol/L)孵育內皮完整的血管環30min，以KCl預收縮，觀察chrysin(10－6mol/L、3×10－6mol/L、10－5mol/L、3×10－5mol/L和10－4mol/L)對血管的舒張作用，對照組加入相同劑量PSS液。以高鉀誘發的最大收縮幅度為100%，建立濃度效應曲線。

4．6鉀通道阻斷劑對chrysin舒張作用的影響用4-AP(10－3mol/L)、BaCl2(10－4mol/L)、Gli(10－5mol/L)或TEA(10－3mol/L)孵育內皮完整的血管環30min，高鉀預收縮，觀察chrysin對血管環的舒張作用，對照組加入相同劑量PSS液。以高鉀誘發的最大收縮幅度為100%，建立濃度效應曲線。

4．7Chrysin對外鈣內流引起主動脈收縮的影響血管環穩定后，用含EGTA的無鈣PSS液洗脫血管環。20min后，當血管環張力回到基線時，將浴液更換為不含EGTA的無鈣PSS液。10min后，將浴液換為無鈣的60mol/LKCl，孵育10min，向浴槽內加入2.5mmol/LCaCl2，待血管環收縮達穩定的坪臺時，仍然用含EGTA的無鈣PSS液去洗脫。20min后，當血管環張力再次回到基線時，將浴液更換為不含EGTA的無鈣PSS液。10min后，向浴槽內分別加入chrysin(10－6mol/L、10－5mol/L和10－4mol/L，chrysin一直存在于浴槽內)，孵育15min，然后將浴液換為無鈣的60mmol/LKCl，孵育10min，再次向浴槽內加入2.5mmol/LCaCl2。以孵育chrysin前含鈣液中60mmol/LKCl的收縮幅度為100%。

5統計學處理結果以均數±標準差(mean±SD)表示。采用GraphPadPrism6作圖，采用SPSS20.0進行統計分析，兩樣本之間比較采用t檢驗，多組間比較釆用one-wayANOVA及SNK法進行顯著性檢驗，以P＜0.05為差異有統計學意義。通過非線性回歸計算IC50值(抑制50%最大收縮時所需要的藥物濃度)或RC50值(產生50%舒張時所需要的藥物濃度)。

二、結果

1Chrysin對大鼠主動脈環基礎張力的影響Chrysin(10－7mol/L、10－6mol/L、10－5mol/L、10－4mol/L和10－3mol/L)對基礎狀態血管張力無明顯影響，見圖1。Chrysin對60mmol/LKCl預收縮的血管環產生濃度依賴性的舒張作用，并且內皮完整組和去內皮組chrysin(10－4mol/L)的最大舒張率分別是(99.69±3.78)%和(58.94±9.62)%，RC50值分別為6.38×10－6mol/L和1.64×10－5mol/L;空白對照組幾乎對血管環張力沒有影響。兩兩比較，差異有統計學顯著性(P＜0.01)，見圖2。

2L-NAME和Indo對chrysin舒張作用的影響Indo(10－5mol/L)組中，chrysin(10－4mol/L)最大舒張率是(94.10±10.18)%，RC50值為8.35×10－6mol/L，與對照組相比對chrysin的舒張作用無明顯影響;而L-NAME(10－4mol/L)組中，chrysin(10－4mol/L)最大舒張率是(63.04±8.67)%，RC50值為4.81×10－5mol/L，與對照組相比差異有統計學顯著性(P＜0.05)，見圖3。

3鉀通道阻斷劑對chrysin舒張作用的影響BaCl2(10－4mol/L)、TEA(10－3mol/L)、4-AP(10－3mol/L)和Gli(10－5mol/L)分別可以特異性阻斷KIR通道、KCa通道、KV通道及KATP通道。在鉀通道阻斷劑的基礎上，chrysin的最大舒張率分別為71.06%±8.95%、66.21%±14.65%、49.41%±5.69%和53.40%±8.99%;RC50值分別為3.16×10－5mol/L、4.43×10－5mol/L、9.72×10－5mol/L和4.43×10－5mol/L。結果表明BaCl2、TEA、Gli和4-AP均能抑制chrysin的舒張血管作用(P＜0.05)，見圖4。

4Chrysin對外鈣內流引起主動脈收縮的影響在無鈣液中，60mmol/LKCl幾乎不引起主動脈發生收縮，加入2.5mmol/LCaCl2后，血管發生收縮，且其收縮幅度與之前正常PSS液中60mmol/LKCl引起的收縮幅度基本相當。提前孵育chrysin(10－6mol/L、10－5mol/L和10－4mol/L)可濃度依賴性地抑制2.5mmol/LCaCl2引起的血管收縮，其IC50值為4.84×10－5mol/L，見圖5。

三、討論

血管疾病主要包括心血管疾病、腦血管疾病和周圍血管疾病，具有發病率高、致死率高和致殘率高的特點，危害極大。資料表明，chrysin是一種黃酮類化合物，具有抗氧化、抗焦慮、抗炎癥、抗腫瘤、化療增敏等多種藥理作用［9，11-13］，而其抗氧化以及抗炎作用被認為對動脈粥樣硬化、糖尿病等引起的心血管病變具有抑制作用，但其對血管的具體作用機制尚不明確。課題組已經證明chrysin對大鼠離體腎動脈具有舒張作用［14］。本實驗旨在研究chrysin對大鼠主動脈的作用及作用機制，結果顯示chrysin對SD大鼠主動脈靜息張力無明顯影響，對KCl預收縮的內皮完整血管環和去內皮血管環均有顯著舒張作用，并且對內皮完整血管環的舒張作用更明顯，呈劑量依賴性。因此，chrysin對血管的舒張作用可能由兩部分組成，部分作用于血管內皮，部分直接作用于血管平滑肌。

血管內皮可通過釋放血管舒張因子和血管收縮因子主動調節血管張力。其中內皮細胞釋放的NO和前列環素是調節血壓的主要因子，在維持血管基礎張力的過程中發揮重要的作用［15］。本實驗應用非特異性一氧化氮合酶抑制劑L-NAME作用于大鼠主動脈環后，chrysin的血管舒張作用部分被阻斷，提示NO參與chrysin的舒張血管作用。前列環素通過激活腺苷酸環化酶，進而可以激活cAMP依賴性的蛋白激酶A，從而介導其舒張血管等生理效應。前列環素由花生四烯酸在血管內皮細胞COX和前列環素合酶的作用下生成，其中，COX是花生四烯酸代謝過程中的重要限速酶之一。然而Indo對chrysin的舒張作用無明顯影響，提示chrysin的舒張作用和前列環素無關。Ca2+是導致血管平滑肌收縮的重要因子，通過細胞內釋放和細胞外流入產生，Ca2+內流途徑主要有受體調控的鈣通道和電壓依賴性鈣通道［16-17］。高鉀引起血管平滑肌收縮機制是由于細胞外高濃度K+引起細胞膜去極化，電壓依賴性鈣通道開放，從而促使細胞外液中或與細胞膜疏松結合的Ca2+內流，因此K+通道活性的改變可使血管平滑肌細胞膜電位超極化或去極化，是參與血管舒張和收縮調節的重要機制。

迄今為止，血管平滑肌上已經發現有4種類型的鉀通道，它們是電壓依賴性鉀通道(KV)、鈣激活的鉀通道(KCa)、ATP敏感性鉀通道(KATP)和內向整流鉀通道(KIR)［18］。結果顯示，4-AP(10－3mol/L)、TEA(10－3mol/L)、BaCl2(10－4mol/L)和Gli(10－5mol/L)均可抑制chrysin的舒血管的作用，提示chry-sin的舒血管作用可能與其開放4種鉀通道有關。而孵育chrysin，可濃度依賴性地抑制2.5mmol/LCaCl2引起的血管收縮，提示chrysin舒張血管作用可能通過抑制電壓依賴性鈣通道的開放，減少細胞外鈣內流，使細胞內Ca2+濃度下降而舒張血管。

作者：田晴晴 羅樂 張夏麗 陳敏 李潔 高雪梅 張明升 張軒萍 單位：山西醫科大學藥理教研室 山西職工醫學院生理學教研室