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《中國脊柱脊髓雜志》2016年第三期

【摘要】

目的：通過研究不同年齡大鼠的終板軟骨細胞氧化應激的差異，探討衰老對終板軟骨細胞抗氧化能力的影響。方法：原代培養獲取SD大鼠2個月、18個月來源的終板軟骨細胞鑒定后，使用第三代細胞進行實驗。實驗分為兩組，A組為2個月大鼠來源的終板軟骨細胞，B組為18個月大鼠來源的終板軟骨細胞。待A、B兩組細胞貼壁后，通過β-半乳糖脫氫酶染色和RT-PCR對端粒酶長度進行檢測，比較兩組細胞衰老的差異；通過總抗氧化能力試劑盒檢測兩組細胞總抗氧化能力的不同。以濃度為200umol/L過氧化氫對細胞進行2.5h的處理，RT-PCR法檢測處理前后兩組細胞Ⅱ型膠原、蛋白聚糖、caspase-3及B淋巴細胞瘤-2（B-celllymphoma-2，bcl-2）的mRNA表達情況，使用流式細胞儀檢測兩組細胞的凋亡情況。對Ⅱ型膠原、蛋白聚糖、caspase-3及bcl-2的相對表達量進行組間t檢驗，P<0.05為差異有統計學意義。結果：未使用過氧化氫處理時，A、B兩組終板軟骨細胞的在β-半乳糖脫氫酶染色、Ⅱ型膠原、蛋白聚糖表達及凋亡率無明顯差異（P>0.05），而B組在端粒酶的相對長度（T/S=10±2）及總抗氧化能力（0.72±0.18）較A組（T/S=135±5，1）顯著降低（P<0.05）。在相同條件的過氧化氫刺激后，B組終板軟骨細胞的Ⅱ型膠原（0.60±0.16）、蛋白聚糖（0.75±0.22）表達明顯低于A組細胞（P<0.05），而凋亡率顯著高于A組細胞（P<0.05）。結論：不同年齡大鼠終板軟骨細胞衰老及抗氧化能力存在差異，衰老越明顯的終板軟骨細胞，總抗氧化能力越低，抵抗過氧化損傷的能力越差。

【關鍵詞】

終板軟骨細胞；總抗氧化能力；衰老；凋亡

脊柱退變性疾病已成為世界性的難題[1]，是成人腰痛[2]及頸肩痛[3]的主要原因之一，給個人及社會帶來嚴重的經濟負擔[1、4]。椎間盤的結構及營養供應具有特殊性[5]，是人體最大的無血管組織，血運少承壓重，較易發生退變。終板軟骨的退變是椎間盤退變的重要因素[6]。目前對于終板軟骨在椎間盤退變中的作用引起廣泛關注[7]，但其機制還有待進一步研究。在不同年齡階段，終板軟骨的形態及功能各有差異[8]，已有研究表明氧化應激在終板軟骨退變損傷中起到重要作用[9]，但對不同年齡階段終板軟骨細胞抗氧化能力的變化未見報道。因此，本實驗擬研究不同年齡階段的終板軟骨細胞在衰老、總抗氧化能力及抵抗過氧化損傷等方面的差異，從氧化應激角度闡釋終板軟骨細胞的衰老及抗炎化能力變化對椎間盤退變的影響。

1材料與實驗方法

1.1實驗動物雄性SD大鼠：2月齡，18月齡，由第二軍醫大學動物中心提供，動物在SPF級飼養室喂養，其溫度為22±1℃，光照12h/d，實驗動物經過第二軍醫大學倫理委員會批準。

1.2終板軟骨細胞的分離培養參照已有的原代終板軟骨細胞提取方法[10]：取目標年齡階段雄性SD大鼠各3只，處死后無菌條件下取出胸腰段脊柱，切除其附著韌帶及結締組織。顯微鏡下分離終板軟骨，剪碎后用0.3%Ⅱ型膠原酶37℃消化45min，然后加入5倍于膠原酶的血清中和后1000rpm離心5min，重懸后經200目濾網過濾，接種于T75培養瓶內。每隔3d換一次培養液，每隔7d進行傳代。本實驗中所使用軟骨細胞均為第三代細胞，使用前經蛋白聚糖及Ⅱ型膠原免疫熒光染色進行鑒定。

1.3不同年齡階段終板軟骨細胞的鑒定細胞分為A、B兩組，A組為2月齡大鼠終板軟骨細胞，B組為18月齡大鼠終板軟骨細胞，所有細胞培養至第3代接種于6孔板內，調整細胞密度為每孔1×105個，待貼壁完全后，進行β-半乳糖苷酶染色，并收集細胞提取總RNA，按照PCR的操作步驟檢測檢測細胞的端粒酶長度。端粒酶相對長度檢測方法參照已有文獻[11]，β-半乳糖苷酶（碧云天）染色檢測細胞衰老情況，嚴格按照產品說明書進行操作。

1.4不同年齡階段終板軟骨細胞所分泌的蛋白聚糖及Ⅱ型膠原的比較分別收集第三代A組和B組細胞，提取總RNA，按照已有文獻方法PCR檢測細胞中蛋白聚糖及Ⅱ型膠原的含量。將第三代第三代A組和B組細胞以1×105個每孔接種于6孔板內，待貼壁后無血清條件下以濃度為200μmol/L過氧化氫處理2.5h，收集刺激后的細胞按照上述方法PCR檢測刺激后蛋白聚糖及Ⅱ型膠原的含量的變化。Ⅱ型膠原（201bp）：上游序列：TGTTGACATTGCAC-CCATGG；下游引物序列為：CAGCCATTCAGT-GCAGATCC；蛋白聚糖（114bp）上游序列：CT-GTCTATCTGCACGCCAAC；下游引物序列為：GATGTCCTCTTCACCACCCA。

1.5不同年齡階段終板軟骨細胞總抗氧化能力及凋亡情況取第三代終板軟骨細胞，以0.25%胰酶消化，中和，離心重懸后，調整細胞密度1×105個每孔接種于6孔板內，待其貼壁后，以總抗氧化能力試劑盒檢測試劑盒（碧云天）檢測不同年齡來源的終板軟骨細胞抗氧化能力的差異。按照上述方法接種細胞于6孔板中，貼壁后無血清條件下以濃度為200μmol/L過氧化氫進行2.5h處理，收集細胞，嚴格按流式凋亡檢測試劑盒說明書通過流式細胞儀檢測兩種細胞凋亡情況。另外收集處理前后的細胞，提取總RNA，按照PCR檢測方法檢測凋亡基因caspase-3和Bcl-2在處理前后的表達情況，引物設計及實驗方法同前。1.6統計方法用SPSS21.0軟件進行統計學分析處理，數據用x±s表示，兩組間均數比較采用t檢驗，P<0.05差異有統計學意義。

2結果

2.1終板軟骨細胞的分離培養與鑒定分離培養得到的第三代終板軟骨細胞，經蛋白聚糖和Ⅱ型膠原免疫熒光染色鑒定，可見絕大部分細胞染色陽性（圖1），證明分離所得到的細胞經三代培養后絕大多數為表達蛋白聚糖和Ⅱ型膠原的終板軟骨細胞。

2.2不同年齡階段終板軟骨細胞鑒定通過β-半乳糖苷酶染色，衰老細胞可被染成綠色。染色結果表明：不同年齡大鼠來源的終板軟骨細胞均有不同程度的衰老，但B組細胞排列較亂，細胞尾端分叉較多，被染成綠色的比例較高，衰老較為嚴重（圖2）。細胞端粒酶相對長度的檢測也表明B組細胞組端粒酶相對長度（10±2）明顯短于A組135±5，差異具有統計學意義（P=0.0356）。

2.3不同年齡階段終板軟骨細胞所分泌的蛋白聚糖及Ⅱ型膠原的比較RT-PCR檢測顯示：兩種細胞所分泌的蛋白聚糖及Ⅱ型膠原在刺激前后分泌量有所不同。刺激前兩組間蛋白聚糖及Ⅱ型膠原表達無明顯差異（P=0.0925，0.0915），刺激后B組所分泌的蛋白聚糖及Ⅱ型膠原明顯減少，兩組間差異顯著（P=0.0356，0.0248，表2）。

2.4不同年齡階段終板軟骨細胞總抗氧化能力的比較試劑盒檢測顯示兩種細胞總抗氧化能力差異明顯（P=0.0328），即B組細胞的總抗氧化能力（0.72±0.18）較A組細胞（1）低。

2.5不同年齡階段終板軟骨細胞凋亡的比較經相同劑量過氧化氫刺激后，B組細胞的caspase-3及bcl-2表達量較高（P=0.0285，0.0428），凋亡率較高（P<0.05）（表3、4）。

3討論

終板軟骨是一種沒有血管分[8]布的，其主要成分包括蛋白多糖、膠原、和水等[12]的結構。椎間盤的營養物質代謝是通過滲透作用實現的[13]，隨著年齡的增長，椎間盤的結構及功能發生改變[14]。水分及蛋白多糖減少，其根本原因是細胞外基質合成酶減少，降解因素如凝血酶-4。、ADAMTS-5、基質金屬蛋白酶（matrixmetalloproteinase，MMPs）分泌增多[15]。正是由于隨著年齡的變化，椎間盤合成與分解代謝不同，所具有的生理功能也有所不同，這就是這篇文章研究的理論依據。在很多種疾病如心血管類，牙科類等疾病的發生發展中抗氧化能力起到重要的作用[16]。雖然活性氧簇（ROS）在信號轉導和抗菌方面起著重要的作用[17]。但它對很多細胞也有殺傷作用[18]。生理條件下，在抗氧化系統的作用下，ROS維持動態平衡，但在病理條件下，會使其失去平衡。隨著年齡的增長，終板軟骨抗氧化能力也隨之變化。

本實驗結果顯示兩種不同年齡來源終板軟骨組織所提取的細胞有所不同。首先在細胞狀態上來講，2月齡的細胞細胞生長速度更快，傳代時間更短，光鏡下，細胞形態佳，分支少，活性強。且經β-半乳糖脫氫酶染色，顯示大齡鼠來源的終板軟骨細胞陽性率更高，衰老更明顯。且經PCR檢測端粒酶相對長度，大齡鼠來源的細胞端粒酶長度相對更短，同生理狀況的衰老相一致，可以一定程度上反應體內終板軟骨的情況。然而，PCR檢測未刺激前不同年齡的終板軟骨細胞的蛋白聚糖和二型膠原的mRNA含量沒有明顯的差異，其可能的原因是，體外的特殊環境將終板軟骨細胞功能分泌的蛋白的表達差異弱化，其表達多有所弱化。因此，采用不同年齡終板組織來源的終板軟骨細胞可以較準確地對來自不同年齡階段的終板終板組織的差異性進行評估[19]。

而對不同年齡階段所取得的終板軟骨細胞經相同濃度的過氧化氫處理后，通過PCR檢測得到18月來源的終板軟骨細胞的二型膠原、蛋白聚糖含量明顯減少，與2個月來源的終板軟骨細胞具有統計學意義；其可能原因是氧化應激通過盤狀結構域受體（discoidindomainreceptors，DDRs）通路氧化應激產生單鏈DNA損傷信號激活共濟失調毛細血管擴張突變（ataxiatelangiectasiamutated，ATM）激酶活性促進受損DNA附近組蛋白磷酸化，上調p53/p21的活性，引發細胞衰老[20]，氧化應激可以上調caspase-3、caspase-7，下調bcl-2[21]，還可以破壞DNA雙螺旋結構[22]，導致軟骨退變，從而細胞分泌功能降低。18月來源的終板軟骨細胞的bcl-2、caspase-3含量明顯增加，與2個月來源的終板軟骨細胞具有統計學意義。其可能原因氧化應激通過使終板軟骨細胞細胞膜發生脂質過氧化，引起細胞膜通透性增加，細胞水腫，從而造成細胞凋亡。通過檢測細胞刺激前后細胞功能、細胞凋亡的差異，進而反應不同年齡的來源的細胞抗氧化能力的不同。

衰老指標的評價中，體外培養不同年齡來源的終板軟骨細胞β-半乳糖脫氫酶染色上有所差異，但量化較難，但PCR端粒酶相對長度檢測可見顯著。兩種檢測方法都說明了不同年齡來源的細胞衰老的不同。β-半乳糖脫氫酶染色，原理在于損傷DNA的測定，而端粒酶相對長度，評價的是染色體端粒酶長度。在客觀上，DNA損傷受到多種因素影響，而端粒酶相對長度較為穩定。原代所提取細胞，均為相對活性較高，分裂能力較強者。體外培養，所使用條件相對優越，因此在以DNA損傷為指標的β-半乳糖脫氫酶染色中，差異可能并不明顯，染色的差異變現說明問題能力較弱。因此，從年齡越大的個體中取得的原代細胞，不一定必然伴隨DNA損傷的顯著增加，這可能是由于P38等DNA修復[23]及抗凋亡基因上調[24]等保護因素有關。年老細胞對氧化應激抵抗能力降低的原因可能是由于相關基因GPR48（G蛋白偶聯受體48）表達降低[25]，保護性蛋白（泛素化蛋白）產生減少[26]，造成的氧化應激及抗氧化緩沖體系功能降低，在總抗氧化能力指標上，具有明顯差異。同時凋亡同退變關系密切。脊椎退行性病變可引起軟骨下骨髓血管的分布減少，管腔變細，導致椎間盤內營養的減少及代謝物的淤積，使椎間盤內的PH值、氧分壓、滲透壓等微環境異常變化，導致終板軟骨細胞的凋亡[27]。椎體終板軟骨的凋亡可引起椎間盤供養障礙而誘發和加速椎間盤退變[28]。因此，普遍存在的氧化應激刺激，對衰老細胞帶來的高凋亡現象，在退變性疾病中可能扮演著重要作用本次實驗比較了來自不同年齡階段大鼠來源的終板軟骨細胞抗氧化能力的差異，證明了年老大鼠所獲得的細胞中端粒酶相對長度較短，在體外相同培養條件下，對過氧化氫損傷的抵抗能力較低，刺激后凋亡情況更嚴重。細胞實驗因其可操控性強，可有效的控制混雜因素，能夠明確各因素間的關系。但因不能完全模擬體內微環境，故最終需要回歸大體進行評價，需進一步研究予以明確。總之，基于以上細胞實驗，可以明確的是：隨著年齡的增加，細胞對于氧化應激損傷的抵抗能力降低，細胞受到氧化應激刺激后更易發生凋亡。這一現象，或對解釋衰老在相關退變性疾病中的作用具有一定意義。

作者：黃曉東 葉曉健 王洋 王偉恒 徐立璋 馬俊 鄧國英 單位：第二軍醫大學附屬長征醫院脊柱外科