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摘要:目的從死亡的野生水鳥標(biāo)本中分離、鑒定病原菌，評估遷徙鳥類傳播人獸共患病原菌的風(fēng)險。方法采集的組織標(biāo)本涂布營養(yǎng)瓊脂平板，分別在需氧和厭氧的條件下培養(yǎng)。分離的菌株使用Phoenix100全自動微生物鑒定儀和16srRNA測序的方法鑒定細(xì)菌種屬，隨后通過PCR的方法檢測病原菌攜帶主要毒力基因的情況。結(jié)果從骨頂雞、鸕鶿和紅嘴鷗等鳥類的組織標(biāo)本中分離鑒定出霍亂弧菌、沙門菌和產(chǎn)氣莢膜梭菌等多種腸道感染相關(guān)的病原細(xì)菌。霍亂弧菌經(jīng)PCR鑒定不屬于O1和O139血清群，無霍亂毒素和毒素相關(guān)菌毛的編碼基因，但是有溶血素的編碼基因。結(jié)論檢測的死亡鳥類個體存在多病原細(xì)菌的感染。

關(guān)鍵詞:野生鳥類；霍亂弧菌；沙門菌；風(fēng)險評估

野生動物被認(rèn)為是“病原的天然儲存庫”，許多烈性的人類傳染病如SARS和埃博拉等，其感染和傳播的源頭都指向野生動物。近些年來，遷徙鳥類傳播禽流感的風(fēng)險也引起全社會的廣泛關(guān)注〔1-2〕。實際上，遷徙的野生鳥類還可能攜帶和傳播各類主要經(jīng)腸道感染的病原細(xì)菌〔3〕，一方面可能對水源環(huán)境和水產(chǎn)養(yǎng)殖造成污染，另外也可能直接或間接的導(dǎo)致人類感染疾病〔4〕，由此產(chǎn)生的生物安全和公共衛(wèi)生問題也值得關(guān)注。但是，野生鳥類感染和傳播人獸共患病原細(xì)菌的報道，特別是來自國內(nèi)的報道非常少。2017年8月，內(nèi)蒙古自治區(qū)某濕地自然保護(hù)區(qū)內(nèi)發(fā)現(xiàn)大量的野生鳥類死亡，本單位采集部分死亡鳥類的組織標(biāo)本，分離和初步鑒定出霍亂弧菌和沙門菌等多種腸道感染相關(guān)的病原菌，本研究可為遷徙野生鳥類攜帶人獸共患病原菌的科學(xué)和疾病防控研究提供參考數(shù)據(jù)。

1材料與方法

1.1材料1.1.1儀器設(shè)備細(xì)菌鑒定使用美國BD公司Phoenix100型全自動微生物鑒定儀，其它為細(xì)菌學(xué)試驗用常規(guī)儀器。1.1.2菌株都柏林沙門菌參考菌株和O1型霍亂弧菌分離株為本室保存的菌株。1.1.3培養(yǎng)基及試劑細(xì)菌培養(yǎng)基和厭氧產(chǎn)氣包購自青島海博生物公司；Trizol試劑為Invitrogen公司產(chǎn)品；PrimeScript™RTreagentKit、PCRMasterMix和DNAMaker等為TaKaRa公司產(chǎn)品；引物合成和測序由吉林省庫美生物公司完成。

1.2方法1.2.1標(biāo)本采集和運輸采集的死亡鳥類推斷死亡時間均在1天以內(nèi)，個體保存完整，觀察體表無明顯的潰爛和傷口；解剖觀察各臟器沒有明顯的出血和壞死病灶，僅腸道有充血或輕微出血的病變。無菌采集心、肝、脾和肺等組織標(biāo)本，并剪取一段病變部位的腸段，放在無菌采樣管中，然后放入采樣箱中加冰袋運送到實驗室。1.2.2細(xì)菌分離培養(yǎng)組織標(biāo)本在腦心浸液瓊脂和胰胨-亞硫酸鹽-環(huán)絲氨酸（TSC）瓊脂平板上劃線接種，分別在需氧和厭氧的條件下培養(yǎng)。1.2.3細(xì)菌鑒定需氧分離培養(yǎng)的典型單菌落首先進(jìn)行革蘭氏染色、鏡檢觀察，然后選擇對應(yīng)的細(xì)菌鑒定卡使用Phoenix100微生物鑒定儀進(jìn)行鑒定；厭氧分離培養(yǎng)的細(xì)菌挑取黑色的單菌落；所有獲得的菌株同時使用通用引物測定16srRNA序列，利用GenBank數(shù)據(jù)庫進(jìn)行BLAST比對，鑒定細(xì)菌種屬。1.2.4細(xì)菌毒力基因的PCR鑒定霍亂弧菌和沙門菌相關(guān)毒力基因的PCR鑒定引物如表1所示，參考相關(guān)文獻(xiàn)合成〔5-10〕。產(chǎn)氣莢膜梭菌參考相關(guān)文獻(xiàn)〔11〕合成4種主要毒素基因（α、β、ε和ι毒素）的鑒定引物，基于PCR鑒定的結(jié)果確定毒素型。1.2.5病毒核酸檢測組織標(biāo)本勻漿后使用Trizol試劑提取總RNA，參照國家標(biāo)準(zhǔn)《禽流感病毒RT-PCR檢測方法NY/T772-2013》和《新城疫診斷技術(shù)GB/T16550-2008》規(guī)定的RT-PCR方法檢測禽流感和新城疫病毒的核酸。

2結(jié)果

2.1細(xì)菌分離鑒定結(jié)果共采集4只死亡野鳥的病料組織標(biāo)本，細(xì)菌分離鑒定的結(jié)果如表2所示。其中有1只死亡的赤頸潛鴨在本研究培養(yǎng)條件下未分離到任何的病原細(xì)菌，有2只野鳥（鸕鶿和骨頂雞）分離到霍亂弧菌，2只野鳥（紅嘴鷗和骨頂雞）分離到沙門菌，其它分離到的致病菌和條件致病菌還包括產(chǎn)氣莢膜梭菌、溫和氣單胞菌和類志賀鄰單胞菌等。

2.2產(chǎn)氣莢膜梭菌毒素分型結(jié)果經(jīng)PCR鑒定，所有分離菌株僅α毒素基因鑒定為陽性，其它3種毒素鑒定均為陰性，說明本次分離的產(chǎn)氣莢膜梭菌均為毒素A型。

2.3霍亂弧菌毒力基因的鑒定結(jié)果PCR鑒定的結(jié)果如表3所示，本次分離的菌株檢測霍亂弧菌特異性膜蛋白o(hù)mpW和溶血素hlyA基因為陽性，而檢測O1和O139血清群的特異性rfb基因以及霍亂毒素ctxA基因、霍亂毒素相關(guān)的菌毛和ChxA毒素基因均為陰性。說明本次分離的霍亂弧菌不屬于O1和O139血清群，也不攜帶霍亂毒素。

2.4沙門菌毒力基因的鑒定結(jié)果經(jīng)PCR鑒定，本次分離的菌株檢測沙門菌侵襲基因invA和四氫葉酸還原酶結(jié)構(gòu)蛋白基因ttrBCA均為陽性，檢測sefA菌毛基因為陰性，而都柏林沙門菌參考菌株檢測3種基因均為陽性。2.5病毒核酸檢測結(jié)果經(jīng)RT-PCR鑒定，所有標(biāo)本檢測禽流感和新城疫病毒的核酸均為陰性。

3討論

從本次死亡野鳥的病料標(biāo)本中分離到多種的病原細(xì)菌，其中類志賀鄰單胞菌和溫和氣單胞菌等是人或動物臨床常見的條件致病菌和繼發(fā)感染的細(xì)菌；產(chǎn)氣莢膜梭菌也是環(huán)境和動物腸道內(nèi)的常在菌，在特殊條件下可能異常的聚積、增殖并產(chǎn)生毒素，導(dǎo)致動物急性發(fā)病死亡〔12〕，也可能導(dǎo)致人類的食物中毒性疾病。而在傳統(tǒng)意義上，霍亂弧菌和沙門菌都是能夠引起原發(fā)性腸道感染的病原菌。霍亂弧菌較多分布在河流入海口等有一定鹽度的水生態(tài)環(huán)境中〔6-7〕，其O1和O139血清群攜帶霍亂毒素，能夠激活腸上皮細(xì)胞的腺苷酸環(huán)化酶，引起cl-離子的分泌和Na+離子的吸收障礙，水伴隨著離子進(jìn)入腸腔，引起嚴(yán)重的水樣腹瀉。而其它非O1/O139血清群菌株也可能攜帶其它的毒力因子，導(dǎo)致腹瀉或者其它的感染疾。例如，近些年新鑒定的cholix毒素（ChxA）〔13〕，是一種真核細(xì)胞延伸因子2（eEF2）特異的ADP核糖基轉(zhuǎn)移酶，可阻止細(xì)胞的蛋白合成，表現(xiàn)強烈的細(xì)胞毒性。本次分離的菌株非O1/O139血清群，沒有霍亂毒素和cholix毒素，可能并非高致病性的菌株。但是這些低致病性的菌株分布在水環(huán)境中，并且可能被遷徙的候鳥攜帶進(jìn)行更廣泛的傳播，也會在霍亂弧菌毒力菌株的進(jìn)化中發(fā)揮重要的作用。沙門菌是世界范圍內(nèi)最常見的食源性疾病的病原菌，分為不同的血清型。本研究中鑒定的3種毒力相關(guān)基因，invA和ttrBCA存在于所有血清型的菌株中，也是沙門菌屬最常用的特異性鑒定基因〔9-10〕。而sefA是沙門菌SEF14菌毛的編碼基因，該菌毛主要存在于腸炎沙門菌（S.Enteritidis）和禽病相關(guān)血清型等O抗原D1群的菌株中〔14〕。本次分離的菌株都不攜帶該菌毛的編碼基因，初步判定并非腸炎沙門菌和引起雞白痢和禽傷寒的S.Pullorum和S.Gallinarum等主要禽病相關(guān)的血清型。下一步的工作中，擬使用沙門菌屬的診斷血清試劑盒鑒定本次分離菌株的血清型，并評估其感染致病的風(fēng)險。本次的野生水鳥死亡事件，經(jīng)實驗室檢查排除禽流感等高風(fēng)險的病毒性感染，分離到霍亂弧菌和沙門菌等可導(dǎo)致人類腸道感染的病原細(xì)菌。具體的病因還有待商榷，因為并不是所有的鳥類都分離到統(tǒng)一的病原菌，病死鳥解剖也沒有觀察到典型的禽類沙門菌病或產(chǎn)氣莢膜梭菌感染導(dǎo)致的多臟器的炎癥、壞死和出血等病變。推測病因可能是環(huán)境應(yīng)激或者食物匱乏等因素導(dǎo)致的鳥類自身抵抗力下降并伴有病原菌的入侵等綜合因素。但是通過本次事件，遷徙的鳥類攜帶的病原細(xì)菌對水源環(huán)境和水產(chǎn)養(yǎng)殖可能造成的污染，繼而導(dǎo)致的生物安全和公共衛(wèi)生問題值得關(guān)注。本次發(fā)現(xiàn)的骨頂雞、鸕鶿和紅嘴鷗等死亡鳥類都是北方常見的夏候鳥，一些抵抗力弱的鳥類死亡可能污染當(dāng)?shù)厮|(zhì)，而其它候鳥隨著遷徙季節(jié)到來還可能將這些病原細(xì)菌擴散到更大的范圍。因此，對遷徙鳥類及其主要棲息地的水質(zhì)等進(jìn)行持續(xù)的監(jiān)測是保護(hù)生態(tài)環(huán)境重要的環(huán)節(jié)。

作者：祝令偉 景潔 梁冰 王瑩 田園 紀(jì)雪 孫洋 初冬 高玉偉 郭學(xué)軍 單位：軍事科學(xué)院軍事醫(yī)學(xué)研究院軍事獸醫(yī)研究所