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摘要:對不同孔徑微孔濾膜富集腫瘤細(xì)胞進(jìn)行研究。分別測定活性K562細(xì)胞、固定的K562細(xì)胞及血液樣本通過孔徑為1、3、5、8、10μm濾膜的濾過率。將固定染色后的K562細(xì)胞作為目標(biāo)細(xì)胞，測定不同濃度目標(biāo)細(xì)胞通過1μm及3μm的時間;選取1～10個目標(biāo)細(xì)胞，分別在未混入細(xì)胞、混入5×105個活性K562細(xì)胞、混入1×106個活性K562細(xì)胞、混入1mL血液后，通過3μm濾膜過濾測得回收率及陽性率。結(jié)果顯示:固定的K562細(xì)胞不可通過1和3μm濾膜，1mL血液樣本不可通過1μm濾膜;目標(biāo)細(xì)胞在未混入細(xì)胞時回收率為60%～70%，混入5×105個活性K562細(xì)胞、混入1×106個活性K562細(xì)胞及混入1mL血液后回收率在40%～65%之間，當(dāng)目標(biāo)細(xì)胞數(shù)為6個及以上時陽性率為100%。研究表明，對直徑大于或與固定K562細(xì)胞相差不大的腫瘤細(xì)胞的富集，可采用孔徑為3μm的聚碳酸酯濾膜。

關(guān)鍵詞:循環(huán)腫瘤細(xì)胞;微孔濾膜孔徑;濾過率;回收率

引言

腫瘤原發(fā)灶或繼發(fā)灶上的腫瘤細(xì)胞，自發(fā)或受外界因素的作用，脫離腫瘤組織進(jìn)入血液循環(huán)系統(tǒng)或淋巴系統(tǒng)，經(jīng)過血液循環(huán)到達(dá)人體別的組織或器官，形成新的腫瘤灶，這些存在于血液中的腫瘤細(xì)胞即為循環(huán)腫瘤細(xì)胞(circulatingtumorcells，CTCs)［1］。循環(huán)腫瘤細(xì)胞的檢測對癌癥的早期檢測、復(fù)發(fā)監(jiān)測、預(yù)后評估及個性化治療等有著重要意義［2］。但是，由于循環(huán)腫瘤細(xì)胞在血液中含量很少，與白細(xì)胞、紅細(xì)胞相差懸殊［3］，這又給循環(huán)腫瘤細(xì)胞的檢測帶來極大的困難與挑戰(zhàn)，因此循環(huán)腫瘤細(xì)胞的富集就非常重要。現(xiàn)有的富集方法主要包括免疫磁分離法、梯度離心法、微流控技術(shù)以及膜濾過分離法等。但是，前兩種富集方法假陽性假陰性高、敏感性差;微流控技術(shù)靈敏度較高，但成本高;而基于細(xì)胞大小的膜濾過分離技術(shù)與微流控原理類似，具有操作簡單、檢測成本低、敏感性高等特點(diǎn)，在臨床應(yīng)用中極具優(yōu)勢。現(xiàn)有的針對膜過濾富集循環(huán)腫瘤細(xì)胞的方法多采用8μm濾膜［4］，對于8μm以下濾膜的研究較少。有研究發(fā)現(xiàn)，細(xì)胞可穿過孔徑比其自身直徑小很多的濾膜［5］，因此筆者進(jìn)一步研究多種濾膜孔徑與腫瘤細(xì)胞回收率之間的關(guān)系，以探索更理想的膜過濾富集循環(huán)腫瘤細(xì)胞方法。

1方法

1.1材料和儀器K562細(xì)胞(中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究所細(xì)胞中心)，可換膜過濾器(北京凱樂思公司)，不同孔徑(1、3、5、8、10μm)聚碳酸酯微孔濾膜(北京升河濾膜公司)，10mL注射器(上海治寧公司)，IX熒光顯微鏡(日本Olympus公司)，DT5-1離心機(jī)(北京時代北利離心機(jī)公司)，RPMI1640培養(yǎng)基(美國Invitrogen公司)，胎牛血清(FBS，美國Hyclone公司)，4%多聚甲醛(北京索萊寶公司)，結(jié)晶紫溶液(北京鼎國盛公司)，紅細(xì)胞裂解液(北京凱樂思科技有限公司)。

1.2實(shí)驗(yàn)過程1.2.1細(xì)胞培養(yǎng)K562細(xì)胞在含有10%FBS、100U/mL青霉素和100μg/mL鏈霉素的RPMI1640培養(yǎng)基中，放置于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)。1.2.2甲醛固定及結(jié)晶紫染色取指數(shù)生長期的K562細(xì)胞，每毫升加入1mL的4%多聚甲醛固定液，室溫固定15min后，PBS洗滌3次。使用500μL結(jié)晶紫染色液染色10min，PBS洗滌3次，用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。1.2.3細(xì)胞濾過率的測定活性及固定的K562細(xì)胞濾過率的測定:分別取濃度為7.2×105～7.4×105/mL的活性的K562細(xì)胞及固定后的K562細(xì)胞200μL，通過1、3、5、8、10μm微孔濾膜。1mL血液濾過率的測定:分別取1mL靜脈血與裂解液按照1:10的比例混勻，8min后離心洗滌，再通過1、3、5、8、10μm微孔濾膜;重復(fù)以上實(shí)驗(yàn)3次，計算每個樣本濾過率:活性K562細(xì)胞濾過率(%)=回收液中活性K562細(xì)胞個數(shù)/實(shí)際所加活性K562細(xì)胞個數(shù)×100%，固定K562細(xì)胞濾過率(%)=回收液中固定K562細(xì)胞個數(shù)/實(shí)際所加固定K562細(xì)胞個數(shù)×100%，1mL血液的濾過率(%)=回收液中白細(xì)胞個數(shù)/實(shí)際所加1mL血液中白細(xì)胞個數(shù)×100%。1.2.4細(xì)胞回收率及陽性率測定將固定染色的K562細(xì)胞作為目標(biāo)細(xì)胞，稀釋后取少量加入96孔板中，靜止2h后，在顯微鏡下找出10個只含有1個細(xì)胞的孔。1～10個目標(biāo)細(xì)胞按照如上方法配置。將不同孔徑的濾膜安裝至可換膜過濾器中，將含有目標(biāo)細(xì)胞的液體吸入過濾裝置中，并用1mLPBS清洗。重復(fù)以上實(shí)驗(yàn)3次，計算每個樣本的回收率及陽性率:回收率(%)=濾膜上的固定K562細(xì)胞數(shù)之和/實(shí)際所加固定K562細(xì)胞個數(shù)×100%，陽性率(%)=濾膜上出現(xiàn)固定K562細(xì)胞的樣本個數(shù)/總樣本數(shù)×100%。

1.3統(tǒng)計學(xué)分析采用方差分析法來分析各組間的差異，兩組間差異用t檢驗(yàn)，P＜0.05被認(rèn)為差異具有統(tǒng)計學(xué)意義，errorbars采用數(shù)據(jù)標(biāo)準(zhǔn)差表示。

2結(jié)果

活性K562細(xì)胞、固定K562細(xì)胞及血液通過不同孔徑的微孔濾膜濾過率及時間的結(jié)果如圖1所示。活性及固定K562細(xì)胞通過1、3、5、8、10μm微孔濾膜后(見圖1(a))，隨著濾膜孔徑增大，濾過率逐漸增大，活性的K562細(xì)胞濾過率明顯大于固定后的K562。活性K562細(xì)胞及固定染色后的K562細(xì)胞均可穿過5、8、10μm濾膜，不能穿過1μm濾膜，固定K562細(xì)胞不能穿過3μm濾膜。同時，將1mL血液樣本分別通過1、3、5、8、10μm微孔濾膜，如圖1(a)所示，8和10μm的濾過率為64%左右，1、3、5μm濾膜的濾過率分別為0%、16.48%、44.23%。固定K562細(xì)胞過濾時濃度與時間的關(guān)系如圖1(b)所示。使用不同濃度固定染色的K562細(xì)胞，分別通過1和3μm濾膜，相同條件下，使用1μm濾膜的過濾時間顯著性大于3μm濾膜過濾的時間顯著性(P＜0.01)。不同條件下目標(biāo)細(xì)胞通過3μm濾膜后回收率的結(jié)果如圖2所示。將1～10個固定染色的K562細(xì)胞作為目標(biāo)細(xì)胞，分別在未混入細(xì)胞、混入5×105個活性K562細(xì)胞、混入1×106個活性K562細(xì)胞、混入1mL血液后，通過3μm濾膜過濾，測得回收率(見圖2)。目標(biāo)細(xì)胞未混任何細(xì)胞，平均回收率可達(dá)60%～70%;目標(biāo)細(xì)胞混5×105個活性K562，平均回收率在45%～60%之間;目標(biāo)細(xì)胞混1×106個活性K562，平均回收率在40%～55%之間;目標(biāo)細(xì)胞混入1mL血液，平均回收率在40%～65%之間。混了活性K562的樣本進(jìn)行過濾時，對1～10個目標(biāo)細(xì)胞的富集影響具有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05);混了血液的樣本進(jìn)行過濾時，對2、4、10個目標(biāo)細(xì)胞富集的影響具有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)。總之，目標(biāo)細(xì)胞在不同樣本溶液中，回收率具有一定差異。不同條件下目標(biāo)細(xì)胞通過3μm濾膜后陽性率的結(jié)果如圖3所示。將1～10個固定染色的K562細(xì)胞作為目標(biāo)細(xì)胞，分別在未混入細(xì)胞、混入5×105個活性K562細(xì)胞、混入1×106個活性K562細(xì)胞、混入1mL血液后，通過3μm濾膜過濾，測得陽性率如圖3所示。目標(biāo)細(xì)胞未混任何細(xì)胞，目標(biāo)細(xì)胞個數(shù)為2時陽性率為90%，目標(biāo)數(shù)為4及以上時陽性率可達(dá)100%;目標(biāo)細(xì)胞混入5×105個活性K562，目標(biāo)細(xì)胞個數(shù)為2時陽性率為73.33%，目標(biāo)數(shù)為4及以上時陽性率可達(dá)100%;目標(biāo)細(xì)胞混入1×106個活性K562，目標(biāo)細(xì)胞個數(shù)為2時陽性率為66.67%，目標(biāo)數(shù)為4時陽性率為93.33%，目標(biāo)數(shù)為6及以上時陽性率可達(dá)100%;目標(biāo)細(xì)胞混入1mL血液，目標(biāo)細(xì)胞個數(shù)為2時陽性率為77%，目標(biāo)數(shù)為4及以上時陽性率可達(dá)100%。混入活性K562細(xì)胞后會對目標(biāo)細(xì)胞富集的產(chǎn)生影響，混入細(xì)胞越多陽性率越低;混入血液后測得的陽性率大于混活性K562細(xì)胞的陽性率。在細(xì)胞個數(shù)為6及以上時，陽性率均可達(dá)到100%。

3討論

實(shí)際臨床循環(huán)腫瘤細(xì)胞的大小在10μm以上，而固定的K562細(xì)胞的直徑約為12μm，活性的K562細(xì)胞約為13μm［5］，K562細(xì)胞與其他細(xì)胞系相比直徑較小，但也在10μm以上，因此本實(shí)驗(yàn)采用與實(shí)際腫瘤細(xì)胞的大小相差不多的K562細(xì)胞進(jìn)行富集的研究，從而可以更好地選出一種合適孔徑的濾膜，以去除直徑較小的白細(xì)胞，保留直徑較大的腫瘤細(xì)胞。本實(shí)驗(yàn)首先檢測活性和固定的K562及血液通過不同微孔濾膜的濾過率，選出1μm及3μm孔徑濾膜用于腫瘤細(xì)胞的富集，同時結(jié)合1μm與3μm濾膜在過濾細(xì)胞的時間效率，進(jìn)一步確定了3μm的微孔濾膜富集腫瘤細(xì)胞系。接下來，在模擬循環(huán)腫瘤細(xì)胞富集的實(shí)驗(yàn)過程中，使用多聚甲醛固定的K562細(xì)胞作為目標(biāo)細(xì)胞，用以模擬循環(huán)腫瘤細(xì)胞。臨床上對循環(huán)腫瘤細(xì)胞進(jìn)行富集與檢測，有對活細(xì)胞的，也有對固定細(xì)胞的。Chen等使用一種微橢圓形過濾器，對轉(zhuǎn)移性乳腺癌患者、非小細(xì)胞肺癌患者、結(jié)腸癌患者血液中的循環(huán)腫瘤細(xì)胞(活性)進(jìn)行了富集［6］;吳源娜等使用基于膜過濾分離技術(shù)的CTC-BIOPSY@，對胃癌患者血液中的循環(huán)腫瘤細(xì)胞(固定)進(jìn)行了富集［7］。筆者在后續(xù)研究臨床樣本時，將會對樣本進(jìn)行固定，對固定細(xì)胞進(jìn)行富集，因此使用多聚甲醛固定的K562細(xì)胞作為目標(biāo)細(xì)胞，用以模擬循環(huán)腫瘤細(xì)胞。經(jīng)多聚甲醛固定后的K562與活性K562細(xì)胞相比，形態(tài)特征無差異，均為圓球形;活性的K562彈性更大，更容易穿過微孔濾膜，而固定的K562穩(wěn)定性增強(qiáng)，硬度增加，較難通過微孔濾膜。Coumans等在對相對直徑較大的細(xì)胞(MDA-466，直徑14.9μm;MDA-231，直徑15.4μm)進(jìn)行過濾時，通過5μm孔徑的氮化硅微篩過濾的回收率約為25%和37%［8］，接下來將1～10個染色固定后的K562細(xì)胞作為目標(biāo)細(xì)胞進(jìn)行富集研究，回收率在60%～70%，某些細(xì)胞數(shù)范圍內(nèi)回收率呈上升趨勢。目標(biāo)個數(shù)為2時陽性率為90%，4個細(xì)胞及以上陽性率可達(dá)100%，證明實(shí)驗(yàn)的可行性。將目標(biāo)細(xì)胞混入5×105個活性K562細(xì)胞及1×106個活性K562細(xì)胞時，整體上回收率及陽性率均比為混入任何細(xì)胞時有所降低，但回收率仍在50%左右，當(dāng)目標(biāo)細(xì)胞數(shù)為6個及以上時，陽性率為100%。Hofman等使用膜過濾分離技術(shù)檢測病人樣本的的循環(huán)腫瘤細(xì)胞，陽性率約為50%［9］。本實(shí)驗(yàn)回收率在40%～65%之間，目標(biāo)細(xì)胞為2個細(xì)胞時陽性率為76.67%，細(xì)胞個數(shù)為4時陽性率為100%，說明當(dāng)血液樣本較少時，使用3μm的濾膜來富集全血中的循環(huán)腫瘤細(xì)胞是值得嘗試的。將目標(biāo)細(xì)胞混入1mL血液中，待紅細(xì)胞裂解后，即可用3μm的微孔濾膜進(jìn)行過濾，相比利用循環(huán)腫瘤細(xì)胞表面標(biāo)記物的富集方法操作簡單，同時避免了由于腫瘤細(xì)胞上皮標(biāo)志物帶來的假陽性或假陰性。

4結(jié)論

本實(shí)驗(yàn)研究活性K562細(xì)胞、固定K562細(xì)胞及血液樣本通過微孔濾膜的濾過情況，選取孔徑為3μm的聚碳酸酯濾膜來完成循環(huán)腫瘤細(xì)胞的富集，同時檢測不同條件下固定的腫瘤細(xì)胞通過3μm微孔濾膜的回收率及陽性率，為今后的臨床腫瘤患者血液樣本通過微孔濾膜富集并檢測CTC提供了可行性的研究。但是，考慮到每毫升血液中CTC含量較少，僅為1～10個，而人體外周血來源容易，因此在完成實(shí)際臨床樣本檢測時，可考慮檢測較大量的樣本，比如3mL血樣，增加檢出的回收率及陽性率，進(jìn)一步確立從外周血富集回收腫瘤細(xì)胞的方法。

參考文獻(xiàn)

［5］劉文娟，鞏萌，崔寧軒，等．不同孔徑微孔濾膜對腫瘤細(xì)胞濾過的影響［J］．臨床檢驗(yàn)雜志，2017，35(3):230-233．

［7］吳源娜，沈潔，楊艷，等．基于ISET技術(shù)的晚期胃癌循環(huán)腫瘤細(xì)胞檢測及其臨床意義［J］．現(xiàn)代腫瘤醫(yī)學(xué)，2016，24(10):1568-1571．

作者：趙霄 劉文娟 李磊 楊水青 余春紅 崔寧軒 王穎 易宗春 單位：北京航空航天大學(xué)生物與醫(yī)學(xué)工程學(xué)院