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《中國獸醫科學雜志》2014年第八期

1材料與方法

1．1樣品采集與處理本研究中的所有囊尾蚴蟲體均采自青海省久治縣哇爾依鄉。利用捕鼠器對該地區草場高原鼠兔進行捕捉和現場剖檢。從腹腔和胸腔內直接將囊尾蚴取出后放置在裝有400mL／L綿羊膽汁的離心管內，用手緊握離心管約10min，待囊尾蚴頭節完全外翻后，迅速夾取1～10條囊尾蚴放置在含有100mL／L福爾馬林溶液的離心管內進行固定。剩余蟲體則轉移到500mL／L乙醇溶液內，用于基因組DNA的提取。

1．2HE染色首先把浸泡在100mL／L福爾馬林溶液中的標本取出，用蒸餾水沖洗1次；放入到蘇木精－伊紅染色液中染色30s，取出標本，充分水洗；放入到10mL／L鹽酸乙醇溶液中分化，取出標本，充分水洗；放入氨水中返藍，取出標本，充分水洗；用伊紅染液染色，充分水洗；然后依次放入到750、800、850、950mL／L乙醇溶液和無水乙醇中進行逐級脫水；用二甲苯透明2次，各5min；最后樹膠封固。

1．3cox1基因的系統發育分析在提取DNA前，將所要提取的囊尾蚴蟲體放在一個1．5mL的離心管內，利用液氮反復凍融幾次，并充分研磨。應用QIAampDNAFFPETissueKit（Qiagen，USA），提取囊尾蚴基因組DNA，并保存于－20℃，備用。從形態學觀察結果可以初步斷定該囊尾蚴為帶屬絳蟲的幼蟲期。依據中間宿主種的特異性，推測該囊尾蚴與豆狀囊尾蚴可能存在較近的親緣關系。利用豆狀囊尾蚴cox1基因的保守區序列設計引物進行PCR擴增，上、下游引物序列分別為5′－TTAGGGTTATGGTCTGGT－3′和5′－ATACATAAGTGCAATCATCAAC－3′［23］。為了減少PCR反應過程中發生堿基錯配，本研究采用了具有高保真性、高擴增效率的PrimeSTARHSDNAPolymerase（TaKaRa，日本）。PCR反應體系為：DNA聚合酶0．5μL，5×PrimeSTARBuffer10μL，dNTP4μL，上、下游引物各1μL（50pmol／L），模板1μL，ddH2O33．5μL。反應條件為：96℃4min；98℃10s，55℃10s，72℃2min，共35個循環；72℃15min。PCR產物經10g／L瓊脂糖凝膠電泳后，切膠回收，送金唯智生物科技（北京）有限公司采用步移法進行序列測定。將獲得的cox1基因核苷酸序列與NCBI數據庫中已錄入的其他帶屬絳蟲的cox1基因序列進行相似性搜索并下載相關序列，通過MEGA5．1軟件中ClustalW程序進行多序列比對；利用鄰接法（Neighbor－Joining，NJ）和最大似然法（MaximumLikelihood，ML）構建分子系統發育樹，進化樹檢驗用自展法（Bootstraptest），選擇1000次重復。選擇同樣以高原鼠兔為中間宿主的棘球屬的多房棘球絳蟲（Echinococcusmultilocularis）和石渠棘球絳蟲（E．shiquicus）作為外群，以確定該囊尾蚴在帶屬絳蟲分類學中的地位和親緣關系。

2結果

2．1樣品采集及處理對50只高原鼠兔的解剖結果顯示，3只呈囊尾蚴感染陽性，囊尾蚴感染率為6％。囊尾蚴主要寄生于高原鼠兔的腹腔內，偶爾見于胸腔，而顱腔內暫無發現有囊尾蚴寄生，其感染強度分別為4、13和28條。囊尾蚴經400mL／L綿羊膽汁刺激后頭節外翻率達100％，表現出很強的生命活性。經100mL／L福爾馬林溶液固定后，頭節能裸露在囊腔外，便于形態學觀察和染色。

2．2囊尾蚴的形態學觀察肉眼直接觀察到高原鼠兔囊尾蚴的外形呈長條形，囊壁較長且透明，富含囊液，經固定后其長度為33～36mm，幼蟲原頭節處為乳白色。HE染色后觀察頭部形態及大?。侯^部有兩圈鉤，外圈鉤形狀較大，內圈鉤形狀相對較小，隱藏在外圈鉤下面，內外兩圈鉤排列較疏松；有4個吸盤，位于頸節上，直徑約100μm（見圖1）。2．3cox1基因核苷酸序列的系統發育分析被檢囊尾蚴的cox1基因開放性閱讀框（openreadingframe）大小為1620bp，在NCBI數據庫中的登錄號為KM042892。采用NJ法和ML法構建的系統發育樹結果均顯示，該絳蟲與豆狀帶絳蟲（T．pisiformis）處在同一個分支上，兩者親緣關系較近，系統發育樹的自展值（Bootstrap）均高達97％（見圖2）。從進化樹上可以看出，該絳蟲與豆狀帶絳蟲的cox1基因遺傳差異高達15％左右。因此，筆者認為該囊尾蚴不屬于豆狀帶絳蟲或其亞種。

3討論

到目前為止，尚未見文獻報道在我國高原鼠兔有感染囊尾蚴，而青藏高原鼠兔分布廣泛，為嚙齒動物優勢物種。此次流行病學調查表明，高原鼠兔囊尾蚴的感染部位主要集中于腹腔，偶爾見于胸腔。感染強度在不同中間宿主體內存在明顯差異。囊尾蚴的形態學觀察結果表明，囊壁較薄，透明，含有豐富的囊液，個體長度差異不大。經綿羊膽汁刺激后頭節均外翻，并暴露出頸節。HE染色后觀察到頭節上有兩圈鉤，外圈鉤較長將內圈鉤隱藏在內，排列相對疏松；有4個吸盤，吸盤上無鉤，稍微突起于頸節表面。被調查囊尾蚴的cox1基因的核苷酸序列與NCBI數據庫已登錄的序列均不相同。依據線粒體cox1基因構建的系統發育樹結構表明，高原鼠兔囊尾蚴與豆狀帶絳蟲在進化上親緣關系較近，但遺傳距離間的差異顯示該囊尾蚴并非為豆狀帶絳蟲或其亞種。經對該囊尾蚴形態學觀察、中間宿主以及cox1基因構建的系統發育樹等結果的綜合分析，可以初步確定該囊尾蚴屬于一未定新種，并建議將其命名為才氏囊尾蚴（Cysticercuscaixuepengin．sp．或者Taeniacaixuepengilarvan．sp．），對其生物學特性的認識還有待于今后更多數據的支持和深入研究。已有的研究表明，高原鼠兔是多房棘球蚴和石渠棘球蚴的重要中間宿主之一，已成為我國棘球蚴病的重要傳染源，對人的衛生健康構成了極大威脅［24－26］。同時，高原鼠兔多房棘球蚴感染情況可作為生態風險安全評估和棘球蚴病防控措施推廣效果評價的指標之一。同樣，也可考慮將高原鼠兔囊尾蚴感染狀況作為有效的評價指標之一。此外，此種囊尾蚴是否感染家畜和人體尚不清楚，它的終末宿主也不清楚，這些問題迫切需要進一步地澄清。人們對帶屬絳蟲幼蟲期的中間宿主檢測，將有助于了解某一區域內該絳蟲蚴病的流行情況。

Mal－sawmtluangi等［10］在印度東北部嚙齒動物體內檢測到一種囊尾蚴，經對其形態學觀察發現，它屬于帶屬絳蟲，隨后經分子生物學確定其為巨頸帶絳蟲（T．taeniaeformis）的中絳期幼蟲———片狀囊尾蚴（Cysticercusfasciolaris）；同樣，Kataranovski等［27］在塞爾維亞野生溝鼠體內也發現了該囊尾蚴，并統計其感染率為29．9％。對于那些既感染野生嚙齒動物同時又感染經濟動物和人的絳蟲蚴（例如：連續囊尾蚴，T．serialiscysticercus）［28］，調查其感染嚙齒動物的情況將有助于制定對當地經濟動物和人群免遭感染的有效保護措施。本研究為我國進一步開展嚙齒動物囊尾蚴蟲種調查和研究提供了方法，也為開展帶屬絳蟲分子的系統進化研究積累了數據。

作者：范彥雷李立婁忠子閆鴻斌李建秋劉聰暖賈萬忠單位：中國農業科學院蘭州獸醫研究所家畜疫病病原生物學國家重點實驗室甘肅省動物寄生蟲病重點實驗室農業部獸醫公共衛生重點開放實驗室