本站小編為你精心準備了豬小腸淋巴結菌群的特點參考范文，愿這些范文能點燃您思維的火花，激發您的寫作靈感。歡迎深入閱讀并收藏。

《中國獸醫科學雜志》2014年第八期

1材料與方法

1．1動物來源試驗所用豬共分為2個品種：長白豬，飼養于江蘇省農業科學院和中國科學院亞熱帶研究所（湖南長沙）；巴馬香豬，飼養于江蘇省農業科學院。飼料中均不含有抗生素和微生物類添加劑，基本信息見表1。

1．2主要試劑細菌基因組DNA提取試劑盒購自天根生化科技（北京）有限公司。DNA凝膠回收試劑盒購自上海碧云天生物技術有限公司。

1．3樣品采集

1．3．1采集方法試驗前禁食1d，正常飲水。稱取試驗豬體重，應用麻醉劑舒泰肌肉注射，麻醉劑量為8mg／kg，待豬處于深度麻醉后進行放血致死，盡快打開腹腔，分離腸段，分別選取含有PPs和不含有PPs的回腸段，避開連接腸系膜的血管，將其結扎為小段，1．5～2．0cm長，盡快剪取腸段并放入無菌生理鹽水中保存。

1．3．2樣品處理超凈臺中剪開腸段，分離出PPs，將其放入無菌平皿中用無菌生理鹽水進行清洗，搖床上涮洗10次，每次5min，以除去黏附于外部的腸內容物和細菌。應用組織勻漿器對PPs進行勻漿后，500r／min離心10min以除去組織碎片。收集上清，用無菌磷酸鹽緩沖液（PBS，0．01mol／L，pH7．2）稀釋至適當濃度后備用。對于不含PPs的回腸，剪取和PPs大小相同的腸段進行清洗和勻漿，操作同上。

1．4細菌的分離純化與培養取100μL組織上清稀釋液涂板，接種于血平板中，37℃恒溫箱倒置培養20h。根據平板上菌落的生長形態、大小、顏色、氣味、溶血性等進行分類，挑取每一類典型菌落接種于液體LB培養基中，37℃恒溫搖床培養過夜后，劃線接種于固體LB培養基上，37℃恒溫箱倒置培養20h，直至長出單菌落并進行革蘭染色鏡檢，初步區分革蘭陰性菌與陽性菌。為了說明腸腔中的細菌已被清洗干凈，同時取100μL最后一次組織涮洗液，以相同的方法進行涂板培養，以無細菌生長為準。1．5分子生物學鑒定分離純化細菌后，應用細菌基因組DNA提取試劑盒提取細菌基因組DNA（操作步驟詳見說明書）。利用細菌通用引物（上游引物：5′－AGAGTTT－GATCGTGGCTCA－3′；下游引物：5′－TACGGT－TACCTTGTTACGACTT－3′）擴增16SrDNA基因片段，預期擴增的目的片段長度為1500bp。反應體系：2μL模板DNA，25μLMix，2μL上游引物，2μL下游引物，ddH2O補足50μL。PCR反應條件：94℃預變性5min；94℃變性30s，55℃退火30s，72℃延伸1．5min，30個循環；72℃終延伸10min。反應結束后取5μL擴增產物，用10g／L瓊脂糖凝膠（含0．5μg／mL溴化乙錠）電泳檢測PCR產物。在紫外燈下觀察，用數字凝膠成像系統記錄試驗結果。將陽性PCR擴增產物應用DNA凝膠回收試劑盒回收純化后（詳見說明書）送上海美吉生物醫藥科技有限公司進行測序。

2結果

2．1細菌16SrDNA基因的同源性分析對分離菌株的16SrDNA基因PCR擴增產物進行10g／L瓊脂糖凝膠電泳，在1500bp處均出現符合大小的目的條帶（見圖1），將PCR產物回收并測序。并將本次測序結果與GenBank中參考菌株16SrDNA基因的核苷酸序列進行同源性比對分析。結果發現，分離菌株與GenBank中參考菌株具有較高同源性，均在97％以上。根據不同屬細菌16SrDNA基因同源性為70％～90％，而同一種內不同株間基因同源性大于99％的判定標準，證實分離株的16SrDNA基因序列均與各自種屬的16SrDNA基因序列相一致，確證是各自種屬的細菌。

2．2細菌分離鑒定

2．2．1PPs黏膜處的菌群從20頭試驗豬的PPs中共分離得到43株細菌（見表2）。其中，大腸桿菌18株，枯草芽胞桿菌7株，蠟樣芽胞桿菌3株，巴氏桿菌、地衣芽胞桿菌、李氏桿菌、豬鏈球菌各2株，短小芽胞桿菌、科氏葡萄球菌、表皮葡萄球菌、鼠鼻羅氏菌、豚鼠氣單胞菌、痢疾志賀菌、奇異變形桿菌各1株。分離菌株的培養特性及形態特征見表3．

2．2．2其他黏膜處的菌群隨機選取5號、6號、7號、17號、18號、19號、20號豬的不含PPs的回腸黏膜段，按照上述方法進行分離鑒定，結果見表4。從7頭豬中共分離到8種細菌，其中，大腸桿菌5株，克雷伯菌3株，豬鏈球菌2株，奇異變形桿菌、嗜水氣單胞菌、解鳥氨酸拉烏爾菌、痢疾志賀菌、蠟樣芽胞桿菌各1株。

2．2．3PPs和其他黏膜處菌群的比較比較5號、6號、7號、17號、18號、19號、20號豬PPs和其他黏膜處細菌種類發現（見圖2），PPs處和其他黏膜處的細菌種類和數量存在差異：其中，大腸桿菌、蠟樣芽胞桿菌、奇異變形桿菌和痢疾志賀菌為兩者共有細菌；而地衣芽胞桿菌只存在于PPs中，克雷伯菌、嗜水氣單胞菌、解鳥氨酸拉烏爾菌和豬鏈球菌只在其他黏膜中檢測得到。

3討論

口服免疫不僅可以有效地誘導消化道黏膜免疫應答，而且能夠通過共同黏膜免疫系統同時加強呼吸道等黏膜處的免疫應答水平。隨著養豬業的不斷發展，豬的口服免疫研究近年來也逐漸受到重視。口服減毒的豬傳染性胃腸炎病毒（TGEV）不僅可以增加豬腸黏膜相關淋巴樣組織（GALT）中抗體分泌細胞的數量、減少病毒的復制，還可以有效降低豬呼吸冠狀病毒（PRCV）的感染概率。大量的研究表明，PPs在消化道免疫中發揮重要功能，不僅表面分布著具有胞吞轉運抗原功能的M細胞，其內部（固有層）也分布有豐富的樹突狀細胞、T細胞和B細胞。Bailey等發現豬小腸黏膜中的CD45RC－NaveT淋巴細胞和記憶性T淋巴細胞主要來源于PPs。可見，PPs是主要的消化道黏膜免疫誘導位點。因此，設計合理的靶向PPs的口服遞送疫苗，對于消化道黏膜免疫研究的突破具有潛在價值。作為黏膜相關淋巴組織的扁桃體是許多病原微生物的入侵位點和藏身之處，如人HIV－1、朊病毒（PrPSc）、豬鏈球菌2型（SS2）［20］等。PPs是否也可作為病原微生物入侵機體的門戶同樣受到關注。有報道發現，一些病原菌通過黏附或者破壞PPs的M細胞入侵機體，如耶爾森菌、沙門菌等。Chassaing等發現，具有長的極性化菌毛（LPF）的黏性侵襲性大腸桿菌（AIEC）通過破壞PPs侵入機體，引起腸道克羅恩病。值得注意的是，本試驗中PPs黏膜中大腸桿菌的檢出率最高，為90．00％。而大腸桿菌是人類和動物腸道中的正常菌群，多不致病，但仍存在部分具有較強致病性的血清型，如腸產毒素型大腸桿菌（enterotoxigenicE．coli，ETEC），可引起較為嚴重的腹瀉。因此，筆者推斷，如此之多的大腸桿菌在PPs中存在可能有兩方面的原因：致病性大腸桿菌利用PPs入侵機體并抑制機體的免疫應答功能；非致病性大腸桿菌在PPs中大量定植，與PPs共同發揮免疫保護作用。但由于本試驗中采用的16SrDNA基因片段PCR擴增技術只能鑒定到種的水平，尚不能確定分離到的菌株的致病力，所以對于大腸桿菌在PPs中大量存在的具體原因仍需進一步研究。

有趣的是，本試驗中發現在豬的PPs黏膜處枯草芽胞桿菌數量較多，檢出率僅次于大腸桿菌；而地衣芽胞桿菌也只在PPs中存在。兩者雖然不是豬腸道內的固有菌群，但卻在土壤和空氣中大量存在。而豬的行為學本能如拱土可能使這兩種細菌在長期進化中逐漸具備了腸道固有益生菌的典型特點。有研究已證實，作為兼性厭氧菌，枯草芽胞桿菌和地衣芽胞桿菌的孢子可以在腸道內存在一定時間。Leser等用枯草芽胞桿菌和地衣芽胞桿菌的孢子飼喂豬，發現在飼喂24h后，仍能在豬的胃腸道內檢測得到。在動物養殖上，枯草芽胞桿菌和地衣芽胞桿菌作為飼料添加劑近年來也逐步被認可。而隨著口服活載體疫苗的不斷發展，新的、安全的疫苗遞送載體不斷被發現，其中，作為飼料添加劑的益生菌更是首選。研究表明，乳酸桿菌、枯草芽胞桿菌等都是很好的活菌疫苗遞送載體。因此，枯草芽胞桿菌和地衣芽胞桿菌作為靶向豬PPs的益生菌活載體口服疫苗載體，更有應用前景。此外，大腸桿菌作為PPs的優勢菌群，盡管存在部分血清型具有致病性的可能，但經過適當的改造重組來減弱毒力，也有望作為一種很好的靶向豬PPs的遞送載體。

比較PPs黏膜和其他黏膜處的細菌種類發現，不含PPs的黏膜中存在較多的條件致病菌，如豬鏈球菌、克雷伯菌、嗜水氣單胞菌等，PPs黏膜中雖然也檢測到奇異變形桿菌等條件致病菌，但其檢出率較低（5．00％）。這可能與PPs的相關免疫功能有關。值得注意的是，在無特定病原小鼠、非人靈長類動物和人上的相關試驗表明，PPs內部的共棲菌群大部分是產堿菌屬細菌（Alcaligenessp．）。而本試驗中從20頭豬的PPs中并未分離到產堿菌屬細菌，可見，豬PPs內部菌群與其他動物存在差異。這也提示我們，在針對不同動物的同一免疫器官設計靶向疫苗時，應考慮到不同動物的具體特點，選取靶動物、靶器官內部特有的定植菌群，設計針對性強、特異性好的細菌活載體口服疫苗。

作者：王曉青劉浩飛楊倩單位：南京農業大學動物醫學院