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《中國獸醫學報》2014年第七期

1材料與方法

1．1Tol微晶體的制備稱取0．3g纖維素衍生物溶解于100mL蒸餾水中，4℃條件下溶脹過夜，備用。稱取Tol1g溶解于20mL乙腈中，纖維素衍生物溶液置于冰水浴中，不斷攪拌條件下，將Tol乙腈溶液緩慢加入100mL纖維素衍生物溶液中，待完全加入后立即過濾得到沉淀，真空干燥研磨后得Tol微晶體。

1．2Tol微晶體顯微形態將Tol微晶體和Tol分別分散于載玻片上，置于生物顯微鏡下觀察其形態特征。

1．3Tol微晶體體外溶出速率分別稱取0．5g的Tol微晶體和Tol原藥，分置于100mL容量瓶中，蒸餾水定容，25℃水浴中連續振蕩，分別于5、10、15、20、30、40、50、60、90、120min時取樣1mL，再補充1mL蒸餾水（25℃），取出的1mL樣品用0．22μm的濾膜過濾，取20μL于高效液相色譜儀測出峰面積，代入標準曲線方程（S＝42921C＋5639，R2＝0．9996）計算出溶液中Tol濃度。

1．4血漿中Tol含量測定方法的建立

1．4．1色譜條件色譜柱為KromasilC18柱（4．6mm×250mm，5μm）；流動相為乙腈∶0．1％乙酸溶液（55∶45），流速為1．0mL／min；柱溫為25℃；紫外檢測波長為240nm；進樣量為20μL。

1．4．2血樣處理準確吸取0．2mL血漿樣品于1．5mL的離心管中，加入0．3mL乙腈，渦旋混合器混合1min，12000r／min離心10min，吸取上清液用0．22μm微孔濾膜過濾，取濾液20μL作HPlC分析。

1．4．3方法專屬性按照1．7．2的方法處理空白血漿、空白血漿加入Tol樣品及家兔口服Tol和微晶體后的血漿樣品，比較色譜圖的差異。

1．4．4標準曲線和最低檢測限精密稱取20．0mgTol原藥，置于50mL容量瓶中，加入甲醇溶解后定容，配置成400mg／L的Tol儲備液。吸取一定量的Tol儲備液用甲醇配置成2．0、4．0、8．0、16、32、64、128、256mg／LTol對照液。取0．18mL空白血漿，加入各濃度的Tol對照液0．02mL，使血漿中的Tol的質量濃度為0．2、0．4、0．8、1．6、3．2、6．4、12．8、19．2、25．6mg／L。按照1．7．2的血漿處理方法處理，進樣20μL分析。以血漿中Tol濃度（C）為橫坐標，以峰面積（S）為縱坐標，做出標準曲線，得到回歸方程和相關系數。用空白血漿制成低溶度的藥物樣品，經處理后測定，將引起3倍基線噪音的藥物質量濃度定義為最低檢測限。

1．4．5精密度和回收率試驗取空白血漿0．18mL，加入0．02mL不同質量濃度的Tol對照液配置成0．8、3．2、25．6mg／L高、中、低3個質量濃度的血漿樣品5份，并按照1．7．2的血漿處理方法處理。取同一高、中、低樣品一日內測定5次，連續測定5日，計算出日內和日間精密度。測定高、中、低5份樣品，以標準曲線測得量與Tol加入量的比值計算回收率。

1．5Tol與微晶體的藥代動力學參數測定

1．5．1給藥及血樣采集家兔在試驗前用不含藥物的家兔專用飼料飼養10d，給藥前禁食12h，隨機分為2組。將Tol和微晶體分別加入適量的蒸餾水制成混懸液，一次性給家兔灌胃，給藥劑量均為10mg／kg。于給藥前及給藥后0．25、0．5、1、2、4、8、12、24、36、48h和3、5、7、10d，分別從各只家兔耳緣靜脈采血，采血量為1mL，肝素鈉抗凝，4000r／min離心取上層血漿，置于－20℃冰箱中備用。

1．5．2樣品測定及數據處理按1．7．2項的方法，測定各血漿樣品中Tol含量。所得數據用DAS2．0藥動學軟件處理，進行各種藥代動力學模型擬合，計算各自數據的藥代動力學參數；用SPSS（19．0）分析血藥濃度和相關藥代動力學參數的差異性。

2結果

2．1Tol微晶體顯微形態Tol微晶體及原藥的顯微形態特征見圖1。Tol原藥呈10～30μm不等的針狀晶體；將Tol制成微晶體之后，晶體大小明顯減小，呈2～5μm不等的不規則晶體。

2．2Tol微晶體體外溶出速率Tol及微晶體的體外溶出速率見圖2。由圖可知，微晶體的溶出速度大于Tol原藥，說明Tol制成微晶體后，由于粒徑減小，其溶出速率得到明顯改善。

2．3方法專屬性色譜圖在選定的色譜條件下，色譜圖見圖3。由圖可知，羥丙基－β－環糊精對藥物測定無干擾，血漿中內源性物質與Tol分離良好，Tol的保留時間在7．8min左右。

2．4標準曲線和線性范圍按照1．7．4的方法得標準曲線方程為S＝16626C＋19394，R2＝0．9996，表明血漿中的Tol質量濃度在0．2～25．6mg／L范圍內線性關系良好，最低檢測限為0．05mg／L。

2．5精密度和回收率試驗精密度和回收率試驗結果見表1。

2．6Tol及其微晶體在家兔體內的藥代動力學結果家兔灌胃給與Tol和微晶體后藥時曲線見圖4，數據采用DAS2．0藥代動力學軟件進行模型擬合，以AIC值最小，R2值最大為判斷依據，結果符合一級吸收二室模型，其模擬方程分別為C（TOl）＝20．296e－0．038t＋4．524e－0．015t－23．439e－0．067t；C（微晶體）＝32．925e－0．089t＋3．167e－0．015t－29．485e－0．082t。具體藥代動力學參數的比較見表2，Tol和Tol微晶體的Cmax分別為（8．925±0．360）mg／L和（12．510±0．525）mg／L，tmax均為24h，AUC（0－∞）分別為（411．605±20．918）mg／L•h和（578．650±11．664）mg／L•h，Tol微晶體相對生物利用度為140．6％。

3討論

3．1Tol微晶體顯微特征及體外溶出微細化的藥物晶體可達幾微米至幾納米，可以明顯增加藥物的溶出速率和在機體內的生物利用度，且無需載體材料，是近十幾年的藥劑學研究熱點［8］。微晶體的制備方法有沉淀法、高壓均質法、噴霧干燥法、蒸發沉淀法、乳化法、超臨界流體結晶法等［9－11］，其中反溶劑沉淀法以操作簡單、成本低、制得粒子粒徑小分布窄等優勢，受到廣泛的運用。Douroumis等［12］用沉淀法制備了卡馬西平納米晶體，明顯增加了卡馬西平的溶出速率。張智亮等［13］采用高壓均質技術將伊曲康唑制成超細晶體顆粒，溶出速率提高了13倍?，F在西羅莫司、阿瑞吡坦、非諾貝特等多種采用晶體微粒化技術生產的新藥在美國已經上市［10］。本試驗采用反溶劑法制備Tol微晶體，由于反溶劑中有大量高分子材料吸附在晶體表面，與Tol形成氫鍵，且不斷地攪拌，阻礙了晶體的生長，使晶體大小明顯小于Tol原藥［12］。體外溶出速率試驗中，由于微晶體晶體大小較原藥明顯減小，使得溶出速率增加，此外，制備微晶體中有少量的高分子材料附著在微晶體表面，增加了晶體表面的親水性，使得溶出速率進一步增加。但是由于晶體類型并沒有改變，其溶解度并沒有明顯的差異，試驗結果與祁雯雯等［4］報道相近。

3．2血漿樣品的處理據報道，采用二甲基亞砜和乙腈聯合處理血漿樣品萃取效率較高，但是由于二甲基亞砜有較強的紫外吸收，使得溶劑峰較高，且有一定的拖尾，影響到藥物峰檢測［14］。根據文獻［15－16］報道和試驗驗證，本試驗采用乙腈沉淀蛋白法測定血漿中的Tol方法操作簡單，專屬性強，精密度高，溶劑峰較低，不影響藥物的測定，平均萃取回收率達90％以上，符合生物供試品分析要求。

3．3藥代動力學分析從藥代動力學參數可知，Tol和微晶體在家兔體內均屬于一級吸收二室模型，與國內外文獻［16－18］報道Tol在多種動物體內藥動學模型相同。吸收速率常速（Ka），達峰時間（tmax）、達峰濃度（Cmax）、藥時曲線下面積（AUC）是衡量藥物吸收速率和程度的重要參數，因此比較了原藥和微晶體的Ka、tmax、Cmax、AUC（0－∞）的差異性，其中Ka、Cmax、AUC（0－∞）差異極顯著。由于Tol在體內的代謝時間較長，增加吸收速率是增加其生物利用度的關鍵。從藥動學參數來看，原藥的吸收速率為（0．067±0．007）／h，而微晶體的吸收速率增加到了（0．082±0．005）／h。由于微晶體只是改變了晶體的大小，并未改變晶體類型，故達峰時間與原藥均為24h，與Kim等［18］的結果相近。但是由于晶體粒徑減小和表面親水性的增加，使藥物更容易溶出，微晶體的達峰濃度（12．510±0．525）mg／L較原藥達峰質量濃度（8．925±0．360）mg／L明顯增加。原藥和微晶體AUC（0－∞）分別為（411．605±20．918）mg／（L•h）和（578．650±11．664）mg／（L•h），計算得相對生物利用度為140．6％，Tol制成微晶體后在家兔體內的生物利用度有很大的提高。高緣等［19］將黃芩素制成納米混懸液，并研究了其在大鼠體內的藥動學特征，結果表明黃芩素納米混懸液明顯的提高黃芩素的生物利用度，與本試驗的結論相符，說明藥物制成微晶體后能有效的提高其生物利用度。

作者：盧朝成符華林張偉金超周濤劉夢嬌張艷麗曹航羅莉單位：四川農業大學動物醫學院動物疫病與人類健康四川省重點實驗室