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《中國獸醫科學雜志》2014年第八期

1材料與方法

1．1試劑、菌株、實驗動物及儀器萘啶酮酸（Nalidixicacid），溴化乙錠（EB）均為Sigma公司產品。rTaqDNA聚合酶等PCR反應試劑均為寶生物工程（大連）有限公司產品。標準菌株大腸桿菌CICC21530由中國工業微生物菌種保藏管理中心提供。普通昆明小鼠，5周齡，雌性：中國農業科學院哈爾濱獸醫研究所實驗動物中心提供。超凈工作臺由上海博訊實業有限公司生產。Bio－RadModel1000／500型電泳儀：Bio－Rad公司生產。2720ThermalCyclerPCR擴增儀由美國ABI公司生產。ChampGel全自動凝膠圖像處理系統由北京賽智創業科技有限公司生產。

1．2EHECO157∶H7菌株DNA模板的提取將EHECO157∶H7菌株接種在5mLBHI液體培養基中，37℃振蕩18h。吸取1．5mLBHI培養基，以10000r／min離心2min。菌泥加入100μL無菌蒸餾水孵育10min，放置在冰盒上冷卻5min，混合物以10000r／min離心2min。移除懸液并于－20℃儲存，作為DNA模板用于之后的PCR分析［6］。

1．3EHECO157∶H7菌株毒力基因的檢測利用提取的分離菌株DNA模板分別對stx1、eaeA、hly、stx2、F4、k99、F17共7種毒力基因進行PCR檢測，反應引物見表1。以標準菌株大腸桿菌CICC21530作為陽性對照。擴增產物在10g／L瓊脂糖凝膠進行電泳（1×TAE，EB染色，20min，120V），凝膠影像用凝膠成像儀進行照相。

1．4大腸桿菌O157∶H7菌株的毒力試驗小鼠飼養在無菌環境下，飼喂滅菌鼠糧和水。選擇36只雌性小白鼠（體重20g±5g），隨機將其分成6組，小鼠在腹腔注射前第2天飲水中添加萘啶酮酸（50μg／mL），接種前第24小時禁食，每只小鼠腹腔接種菌液0．5mL，濃度梯度為1．0×1010、1．0×109、1．0×108、1．0×107、1．0×106CFU／mL，共5個梯度。對照組注射等體積的生理鹽水。根據各組的死亡情況，依照改良寇氏法計算最小致死量（MLD）與半數致死量（LD50）。

1．5大腸桿菌O157∶H7菌株的致病性試驗將大腸桿菌O157∶H7菌株接種于BHI培養基中，37℃振蕩24h，倍比稀釋后，均勻涂布于LB固體培養基，進行菌落計數。根據計數結果，細菌懸液用生理鹽水稀釋到1．0×1010CFU。小鼠在腹腔注射前第2天飲水中添加萘啶酮酸（50μg／mL），在接種前第24小時禁食，每只小鼠腹腔接種菌液0．2mL（1．0×1010CFU），對照組注射等體積的生理鹽水。接種后24h內觀察各組小鼠的死亡情況。

1．6患病小鼠的組織學檢查小鼠被處死之后，立即解剖，分離肺、腎、腸道、脾、心臟和肝，并檢查顯而易見的病理變化。對病理組織在含40mL／L甲醛的PBS中固定24h，進行脫水處理，石蠟包埋，做4μm厚的連續切片，HE染色并用光學顯微鏡進行觀察。

2結果

2．1分離菌株毒力基因的檢測毒力基因的PCR檢測結果表明，stx1、eaeA、hly三種毒力基因均為陽性（見圖1）。

2．2大腸桿菌O157∶H7菌株的毒力試驗小鼠腹腔注射0．5mL（1．0×1010CFU）大腸桿菌O157∶H7，18h后前三組開始出現死亡現象，注射后第48小時第4組出現死亡現象，第5組沒有死亡現象（見表2）。根據各組小鼠的死亡數計算出的最小致死量和半數致死量分別為5．0×106CFU和7．9×107CFU。

2．3大腸桿菌O157∶H7菌株的致病性試驗小鼠在接種后第7小時出現全身癥狀，包括嗜睡、厭食、脫水、無尿、被毛散亂、呼吸急促，但沒有發展為神經癥狀，至第18小時全部死亡。對照組小鼠無異常癥狀。死亡小鼠剖檢后病變主要為：肺、心臟、腎、肝均有不同程度的腫大或出血；肺部切面呈暗紅色，小腸有明顯的黃色黏稠積液，腸黏膜充血，腸腔擴張，腸壁變薄、透明。臟器細菌回歸檢測，陽性率為100％。

2．4組織學檢查致病小鼠的心臟腫大，心耳淤血。病理組織學檢查發現，心肌纖維斷裂，肌細胞破裂。間質充血，心臟動、靜脈淤血（見圖2A）。肝眼觀出血點明顯，淤血，體積增大，切面脆弱呈顆粒狀。組織學檢查時肝門靜脈淤血嚴重，上皮細胞壞死、脫落，少量肝細胞壞死，細胞核碎裂，細胞質溶解，間質有紅細胞浸潤（見圖2B）。小鼠脾暗紅色，病理組織學檢查時可見有多量紅細胞浸潤（見圖2C）。肺眼觀淤血，顏色變深，有出血點，腫大。病理組織學檢查時發現細支氣管上皮細胞變性、壞死，核仁溶解，管腔中觀察到脫落的上皮細胞。肺泡擴張，充血，肺泡隔增厚，間質淤血（見圖3A）。腎顏色蒼白，水腫，病理組織學檢查發現腎小球上皮細胞腫脹、破裂，細胞變性但未觀察到壞死，細胞質疏松，腎小管細胞腫脹，管腔變窄，細胞破裂（見圖3B）。小腸腸壁變薄，透明、腫大有氣泡，血管充血，腸腔內充滿黃色液體，尤其以十二指腸最為嚴重。十二指腸病理組織學觀察可見，固有層變薄，局部上皮細胞壞死、脫落，杯狀細胞破碎，胞質疏松，細胞脫落，無完整結構，可以觀察到有少量細胞核溶解，輕度炎性細胞浸潤（見圖3C）。對照組小鼠未觀察到病理組織學變化。

3討論

據WHO估計，1982－2005年美國每年有250人死于大腸桿菌O157∶H7，英國、法國等國都有出現人感染后的死亡現象［9］。O157∶H7具有較強的感染力，一般大腸桿菌需要100萬個活菌才可引起發病，而O157∶H7只需100到200個活菌即可突破胃酸屏障，引發感染。各年齡段人群對O157∶H7都易感，但兒童和老年人最易發病且癥狀較為嚴重。臨床資料統計表明，EHEC的潛伏期通常是3～4d，感染患者大多急性發病，常突然發生劇烈腹痛和非血性腹瀉，數天后出現血性腹瀉，低熱或不發熱，表現為水樣便、黏液便或膿血便。大腸桿菌O157∶H7具有多種毒力因子，但在長期的進化過程中，毒力因子也存在從其他菌株獲取或缺失的現象，導致部分大腸桿菌O157∶H7毒力的改變。喪失毒力的大腸桿菌O157∶H7在生化特性、血清學試驗中與其他大腸桿菌O157∶H7的表型幾乎完全一致。因此，傳統的流行病學調查并不能展現出大腸桿菌O157∶H7的毒性與威脅程度，對分離菌株進行毒力因子的檢測具有重要意義。人類感染大腸桿菌O157∶H7后，發病與sstx1、tx2等致病基因有關。愛爾蘭、西班牙、芬蘭、阿根廷等經常有大腸桿菌O157∶H7的暴發或散發，分離的大腸桿菌O157∶H7菌株大部分攜帶stx1、stx2、eaeA基因。本試驗在采取的病料中成功地分離出1株出血性大腸桿菌O157∶H7。根據文獻的報道，筆者主要針對stx1、stx2、eaeA和hly等4種毒力基因以及F4、F17、K99菌毛進行檢測。

PCR檢測結果表明，該菌株含有stx1、hly、eaeA三種毒力基因，從而使該菌株有一定的致病性。可見，在不同條件下分離的出血性大腸桿菌O157∶H7含有的毒力基因的種類有所不同，并且產生不同的致病能力。國內外相關研究表明，成年的IQI、BALB／c、昆明小鼠等對O157∶H7均不易感［11］。陳亢川等［12］以大腸桿菌O157∶H7經腹腔注射感染小鼠，出現了臨床癥狀及死亡。孫洋等使用絲裂霉素和萘啶酮酸處理的小鼠，經口服途徑感染O157∶H7，出現了主要病理變化和部分臨床癥狀。但這些試驗均未摸索出大腸桿菌O157∶H7的半數致死量，為后續的研究帶來了不便。本試驗在小鼠飲水中加入萘啶酮酸（50μg／mL），萘啶酮酸抑制了小鼠體內的正常菌群，增強了分離菌株對小鼠的易感性。經過腹腔注射活菌的小鼠在1～5d內發病、死亡，利用改良寇氏法測算出大腸桿菌O157∶H7的半數致死量要比謝運冰等報道的偏高，可能與環境或其他原因有關。

LD50的測定使其與其他不同菌株或疫苗菌株的比較有了一個準確的劑量參照，為進一步研究奠定了基礎。EHECO157∶H7感染所引起的經典的組織病理學變化包括腸黏膜固有層的出血和水腫，結腸活檢標本會顯示出中性粒細胞浸潤，典型的人腎組織病理學變化包括腎小球內皮細胞腫脹和血小板及纖維素在腎小球的沉積。有報道稱，用EHEC感染無菌豬、鏈霉素處理的老齡鼠、幼兔可以引起消化道病變及神經系統疾病或者死亡，然而，這些動物模型并未觀察到出血性結腸炎和腎小球的病理變化［15］。本研究中患病小鼠癥狀顯示腎病變以水腫和無尿為主，腎的病理變化主要集中于腎小管和腎小球上皮細胞破裂，胞質疏松。感染引起腸管各層結構受到嚴重破壞，黏膜壞死、脫落，血管充血，腸壁變薄，細胞脫落，無完整結構，尤其以十二指腸最為嚴重。結腸未出現顯而易見的病理變化，可能與使用萘啶酮酸處理小鼠有關。患病小鼠出現呼吸急促，剖檢后發現肺有出血點、腫大，病理變化顯示支氣管上皮細胞變性、壞死，肺泡擴張、充血、出血。本研究結果表明，幼齡小鼠經萘啶酮酸處理，提高了幼齡小鼠對EHECO157∶H7的敏感性，從而觀察到了明顯的病理學變化，為進一步研究EHECO157∶H7的致病特性以及毒力因子在致病特性中所發揮的作用奠定了試驗基礎。

4結論

EHECO157∶H7黑龍江分離株毒力較強，可造成小鼠肺、肝、腎、心臟、脾以及小腸出現不同程度的出血及細胞變性、壞死，其中對肺泡、腎小球、腎小管以及十二指腸的破壞力最為嚴重。

作者：張力國盧婷趙明禮梁偉峰孫冬冬孫思超周國輝師東方于力劉云單位：東北農業大學動物醫學學院中國農業科學院哈爾濱獸醫研究所