本站小編為你精心準備了豬源化抗體對桿狀病毒的影響參考范文，愿這些范文能點燃您思維的火花，激發您的寫作靈感。歡迎深入閱讀并收藏。

《中國預防獸醫學報》2014年第八期

1材料和方法

1.1輕鏈與重鏈全長基因的克隆將鑒定陽性的克隆質粒通過重疊延伸PCR(SOE-PCR)擴增鼠-豬嵌合輕鏈和重鏈的全長基因，分別用LV-F/LC-R擴增輕鏈全長序列，用HV-F/HC-R擴增重鏈全長序列。PCR反應條件：94℃5min；94℃1min、56℃(輕鏈)30s/56℃(重鏈)1min、72℃(輕鏈)1min/72℃(重鏈)100s，共30個循環；72℃10min。擴增產物經1%瓊脂糖凝膠電泳檢測。將擴增的輕鏈與重鏈全長的基因片段進行膠回收，克隆于pMD18-T載體中進行測序鑒定。

1.2重組質粒的構建及鑒定將鼠-豬嵌合輕鏈全長序列(BamHⅠ/EcoRⅠ雙酶切)及鼠-豬嵌合重鏈全長序列(XhoⅠ/NheⅠ雙酶切)分別克隆于pFast-Bac-Dual的兩個啟動子之下，并對重組質粒測序鑒定。

1.3鼠-豬嵌合單鏈抗體(scFv)的表達按照Bac-to-BacBaculovirusExpressionSystem操作指南進一步構建含有鼠-豬嵌合的輕鏈和重鏈基因的桿粒，并利用CellfectionⅡ轉染試劑將其轉染于Sf9昆蟲細胞中，27℃培養拯救表達scFv的桿狀病毒，當細胞病變(CPE)達80%以上，收集上清液和細胞。

1.4scFv的表達和純化分別取上清液和沉淀，SDS-PAGE檢測蛋白的表達情況，參照文獻[8]的方法利用Ni-NTAPurificationSystem進行重組蛋白(scFv)的純化。

1.5scFv的westernblot鑒定將重組桿狀病毒感染的細胞裂解物經SDS-PAGE電泳后，轉印至硝酸纖維素膜上，采用含5%脫脂乳的PBST4℃封閉過夜。以純化的scFv作為一抗(1∶100)，以羊抗豬IgG-HRP(1∶5000)為二抗，DAB試劑盒避光顯色檢測。

1.6scFv活性檢測將H.parasuis分離株HLJ-018包被ELISA板，經5%脫脂奶粉封閉，以純化scFv(1∶150)為一抗，以羊抗豬IgG-HRP(1∶10000)為二抗，TMB顯色，酶標檢測儀測量OD450nm值。

1.7scFv體外抑菌試驗分別將PBS、MAb1D8和純化的scFv與稀釋HLJ-018菌液混合后置于37℃水浴鍋中孵育1h，分別取出3種混合液100μL均勻涂布于TSA培養基上，37℃培養過夜進行菌落計數。

1.8scFv體內抑菌試驗將18只6周齡的BALB/c雌鼠，隨機分成3組，每組6只，腹腔被動免疫PBS、MAb1D8與純化的scFv，接種后1h，分別腹腔注射處于對數生長期的致死劑量的HLJ-018(1010cfu/mL)。觀察小鼠的死亡情況。

2結果

2.1鼠源抗體可變區輕和重鏈及豬源抗體恒定區輕和重鏈的擴增及克隆

2.1.1可變區輕和重鏈及恒定區輕和重鏈的擴增RT-PCR分別擴增鼠源抗體可變區輕、重鏈與豬源抗體恒定區輕、重鏈，分別得到預期目的片段，測序結果也與預期相符。

2.1.2重組質粒的構建采用SOE-PCR法擴增輕鏈與重鏈全長編碼序列，電泳檢測分別約為750bp和1300bp的兩個DN段。

2.1.3重組質粒的構建及鑒定將全長鼠-豬嵌合抗體的輕鏈和重鏈編碼序列經雙酶切，分別克隆于pFast-Bac-Dual的兩個啟動子之下構建重組轉移質粒。經雙酶切鑒定結果顯示，兩個目的片段約為750bp和1500bp，與預期相符，并將其轉化于E.coliDH10B中制備重組桿粒。

2.2鼠-豬嵌合scFv的表達及鑒定通過轉染試劑，將重組桿粒DNA轉染于Sf9昆蟲細胞，27℃培養拯救重組桿狀病毒，經過3次傳代后細胞出現明顯的CPE。當CPE達到80%～90%時，收集上清液和沉淀，SDS-PAGE檢測鼠-豬嵌合scFv的表達；以羊抗豬IgG-HRP作為二抗，通過westernblot鑒定鼠-豬嵌合scFv的豬源部分恒定區。ELISA檢測scFv的免疫原性將H.parasuis作為包被抗原，通過ELISA方法檢測嵌合scFv與H.parasuis的特異性結合活性。結果顯示，重組表達的嵌合scFv與H.parasuis能夠特異性結合，表明獨立表達的嵌合輕鏈和重鏈能夠自主組合為具有特異性結合活性的scFv。

2.3scFv體外抑菌試驗將純化的嵌合scFv與處于生長期的H.parasuisHLJ-018株混勻，37℃水浴30min之后，涂布于TSA培養基上，37℃孵育過夜，然后進行細菌計數，結果顯示，scFv具有良好的抑菌活性。

2.4嵌合scFv體內抑菌試驗在BALB/c小鼠的腹腔中分別注射0.5mg純化后的MAb1D8、純化后的scFv和等體積的PBS，接種后1h，以致死劑量的H.parasuisHLJ-018株(1010cfu/mL)攻毒，觀察小鼠的存活情況。結果表明，陰性對照組的小鼠在注射致死劑量的HLJ-018后18h，死亡4只；攻毒后32h，陰性對照組的小鼠完全死亡；嵌合scFv與MAb1D8組小鼠死亡時間均被推遲，而且半數小鼠被保護并存活。

3討論

本研究通過以具有交叉保護作用抗H.parasuisMAb1D8的cDNA為模板擴增其輕、重鏈的可變區，作為構建scFv可變區序列，鼠源MAb可變區框架經BLAST篩選和確定后，設計引物可以擴增出目的序列。對于豬源恒定區的序列擴增，是將GenBank中收集的豬IgG序列進行比對，確定豬源抗體的恒定區序列，設計引物進行擴增獲得恒定區全長。引物設計的準確與否直接關系到可變區與定區的擴增效率，并為進一步嵌合抗體的構建奠定了基礎。抗體的輕、重鏈是通過二硫鍵的作用結合到一起的，本研究利用pFast-Bac-Dual穿梭質粒，構建雙向表達重組質粒。最終表達的scFv，經過westernblot、ELISA驗證后，結果表明，構建表達的重組蛋白具有特異性的抗原結合活性。效力驗證分別通過體內、外的抑菌試驗進行。體外抑菌試驗表明，scFv具有識別并抑制H.parasuis生長的能力；小鼠的體內抑菌試驗結果顯示，MAb1D8和scFv組的小鼠與陰性對照組的小鼠相比，死亡時間延長，死亡比例降低。本研究構建的豬源scFv對于H.parasuis的感染具有明顯的保護作用，可以作為潛在的治療生物制劑進一步研究。

作者：楊玉菊姜福成柴政符芳鄭楠王香玲郭殿磊李曦單位：中國農業科學院哈爾濱獸醫研究所獸醫生物技術國家重點實驗室 豬傳染病研究室哈爾濱學院