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《中國預防獸醫學報》2014年第八期

1菌毛表達

Ⅰ型菌毛表達嚴格受到外界環境的影響，溫度、pH、滲透壓、培養基等因素在一定程度上均影響菌毛的表達。惲時鋒等將禽源大腸桿菌分離株MG40e(O88)、MG38e(O88)、Q33c(O115)、MG30e(O88)分別于37℃、28℃、18℃培養72h，結果顯示僅37℃培養時能表達大量細長而密集的菌毛，低于37℃只表達少量菌毛或無菌毛[11]。Schwan等發現，酸性培養條件下fim啟動子(fimA，fimB，fimE)的表達都輕微下降；中性培養條件下增加滲透壓(400mMNaCl)則fimA和fimB的轉錄下降約50%，當滲透壓進一步升高(800mMNaCl，fimA和fimB轉錄下降近3倍，而fimE的轉錄卻輕微上升；酸性條件下增加滲透壓(800mMNaCl)使fimA和fimB的轉錄水平下降5倍，而fimE的轉錄量卻是原來的2倍。由此證明高滲及低pH會抑制Ⅰ型菌毛的表達，并且其下調是通過介導相變開關的狀態實現的[12]。此外，培養基的選擇也影響到Ⅰ型菌毛表達。肉湯培養基比固體培養基更有利于菌毛表達，液體肉湯靜置培養會使得細菌最大程度地表達Ⅰ型菌毛。這是因為環境中疏水菌毛使得細菌在液氣界面形成一個薄膜層，以便最大程度的獲取大氣氧。無菌毛表達的菌株經過幾代靜止培養連續傳代后，部分菌株菌毛化。再將它們接種到固體平板上培養幾代之后，又顯示甘露糖敏感性血凝試驗陰性(MSHA-)[13]。

2生物學相關特性

作為Ⅰ型菌毛結構性蛋白FimH，介導Ⅰ型菌毛凝集特定動物紅細胞以及酵母細胞。紅細胞膜上含有甘露糖低聚寡糖，酵母細胞壁中的主要成分是甘露聚糖，FimH能結合甘露糖發生凝集反應，而且該凝集性能被D-甘露糖所抑制，因此Ⅰ型菌毛又稱為甘露糖敏感性(Mannosesen-sitive，MS)菌毛。不同種類動物的紅細胞糖鏈差異性，因而不同菌株的凝集譜不同。在禽源沙門氏菌菌株中存在Ⅱ型菌毛，在遺傳和免疫水平上與鼠傷寒沙門氏菌Ⅰ型菌毛密切相關，它擁有完整的FimH，但卻無甘露糖敏感性、凝集活性以及體外黏附細胞的能力，可能是由于N末端區域的一小部分氨基酸的置換所導致的。FimH的晶體結構研究表明，糖結合區域位于N末端aa1～aa156，而與菌毛柄相關的區域則位于C末端aa160～aa277。然而，研究表明，Ⅰ型菌毛的結合特異性不僅是由FimH亞單位決定的，它也受由FimA構成的菌毛軸所調節[16]，或許是通過它強加于FimH上的構像限制實現的。鑒于Ⅰ型菌毛是由甘露糖特異性結合特性來定義的，但越來越多的研究數據表明，在不同的菌屬中，存在Ⅰ型菌毛異質性，例如在大腸桿菌、傷寒沙門氏菌、肺炎克雷伯氏菌中就存在顯著的差異，而即使是相同的菌種，也存在結合機制不同[18]，可能與FimH的共價結構有關。Sokurenko等研究表明有兩種類型的甘露糖敏感性Ⅰ型菌毛，一種為我們所熟知的甘露糖凝集素活性，必須結合包含有甘露糖的糖蛋白；而另外一種不僅具有MS凝集素活性，還可以與非糖基化的蛋白片段結合，并且其結合能夠被甘露糖所抑制[19]。Ⅰ型菌毛這一特性賦予了細菌黏附至多種細胞的能力，包括紅細胞、上皮細胞、粒細胞、巨噬細胞及肥大細胞等。Ⅰ型菌毛這種功能上的差別可能與它的組成蛋白FimA、FimF、FimG、FimH或者它們聚合成菌毛絲的方式有關，具體機制仍有待研究。

3致病性

Ⅰ型菌毛是細菌重要的毒力因子，可通過促進對宿主粘膜表面的黏附、侵襲以及引發機體的免疫應答等途徑增強細菌的致病力。典型的例子為UPEC，它在泌尿道上皮細胞上的受體屬于尿路上皮特異蛋白(Uroplakin)，一種甘露糖含量很高的糖蛋白，分布在傘狀泌尿上皮細胞表面。一些動物模型試驗均表明Ⅰ型菌毛增加了UPEC在泌尿道中存活幾率。

3.1黏附能力一直以來，Ⅰ型菌毛被認為是普遍存在于腸道致病菌表面的黏附因子，通過其頂端的FimH蛋白與甘露糖受體以化學鍵特異性牢固結合，介導致病菌黏附至宿主上皮細胞，以避免因震蕩、沖刷而脫離粘膜上皮，為進一步侵入機體創造條件。由于一個菌株中一般具有許多黏附因子，而這些基因的相互作用、對細菌毒力因子的影響等眾多因素形成的復雜調節網絡，從而使得單獨研究一種特定的黏附素作用變得異常困難。Krekeler等發現利用在不含有其它已知黏附素基因的UPEC菌株P4(分離自有子宮積膿臨床癥狀犬的子宮)上插入突變fimH基因，導致對于犬子宮內膜的黏附顯著下降，只有野生株的0.3%。這一研究結果首次證明Ⅰ型菌毛在促進大腸桿菌對子宮內膜黏附作用中的關鍵作用。Trautner等發現將fim+質粒轉化入非致病菌E.coli83972中，可以顯著提高其黏附能力并且增強對后續致病細菌定植的干擾能力。本實驗室構建了幾株禽致病性大腸桿菌分離株的Ⅰ型菌毛fimH基因缺失株，通過人肺上皮細胞(A549)和嗜中性粒細胞(分離自3日齡健康雞血)的黏附試驗，表明禽致病性大腸桿菌的Ⅰ型菌毛可以促進細胞的黏附與定植。一些研究者發現由于Ⅰ型菌毛在致病性(分離自有泌尿道疾病的犬)和非致病性(分離自犬腸道)大腸桿菌中有著同樣的高頻度表型，因而表明Ⅰ型菌毛對于致病性幾乎無貢獻。而一些學者則強調大腸桿菌Ⅰ型菌毛的相變性可能會影響對泌尿道的致病力，因為Ⅰ型菌毛的表達可能會依賴細胞微環境，進而對細菌的毒力貢獻不同。因此，今后Ⅰ型菌毛研究不僅僅局限于其基因的分布，而應拓展到mRNA和蛋白水平。在沙門氏菌和肺炎克雷伯氏菌中，Ⅰ型菌毛均介導了不同程度的黏附功能。

3.2侵襲能力除了黏附性能外，Ⅰ型菌毛在對細胞的侵襲過程中同樣發揮重要的作用。Boudeau發現分離自患有克羅恩氏(Crown''''s)疾病患者體內的大腸桿菌菌株LF82具有黏附、侵襲一些列腸道上皮細胞的能力(包括細胞系407、Caco-2、HCT及HEp-2)，而它本身不含有已知的一些黏附侵襲因子，因而被歸為一種新的潛在致病菌AIEC(Adherent-invasiveE.coli)。在菌株LF82的fim操縱子中插入突變后，大部分菌株均喪失侵襲能力，這進一步驗證了它的侵襲能力是由Ⅰ型菌毛介導的。此外，在其它大腸桿菌以及沙門氏菌中，均有Ⅰ型菌毛影響細菌侵襲能力的研究報道。然而，不同的菌種甚至是同一菌種不同的變種和型，都可能具有不同程度的侵襲能力。例如，牙周病致病菌牙齦樸琳單胞菌中，根據fimA序列的不同分為6個基因型，除了具有Ⅱ型fimA的菌株黏附侵襲能力最強，其它所有基因型均有黏附能力，而它們對于人口腔上皮癌細胞(KBcells)的侵襲效率并不高，而且程度不同。有研究表明在氣單胞菌中，利用fim操縱子的缺失株與野生株進行體外試驗，缺失株黏附能力顯著下降，而侵襲能力卻無變化。由此表明，雖然Ⅰ型菌毛在某種程度上介導了細菌的侵襲能力，增加了致病性，但其內在機理還有待進一步研究。

3.3生物被膜形成能力許多研究表明在UPEC中，Ⅰ型菌毛有促進生物被膜形成的能力，對于細菌起始黏附至泌尿生殖道并引發感染的過程起到了關鍵的作用。Jen-nifer等發現，兩個具有MSHA活性的鼠傷寒沙門氏菌分離株卻呈現不同的生物被膜形成能力，它們的區別在于FimH的兩個氨基酸位點存在突變，而將位于61位的甘氨酸置換成丙氨酸即可賦予菌株形成生物被膜的能力。然而，也有很多研究表明Ⅰ型菌毛對生物被膜的形成無調節作用甚至是負相關的。例如，大多數肺炎克雷伯氏菌均表達Ⅰ型和Ⅲ型菌毛兩種黏附素，Ⅰ型菌毛是引發UTI的關鍵，但卻發現Ⅰ型菌毛的表達會下調生物膜的形成，非毒力因子的Ⅲ型菌毛卻有促進生物被膜形成的能力。在新洋蔥伯克霍爾德菌中，Ⅰ型菌毛對于生物被膜的形成也是非必需的[30]。總而言之，Ⅰ型菌毛對于細菌生物被膜的調控涉及到很多調控因子，而對于這一領域的深入研究有助于詮釋Ⅰ型菌毛的致病機制。

3.4免疫反應Ⅰ型菌毛在引發宿主免疫應答方面的關鍵作用應引起關注。早期研究表明Ⅰ型菌毛可以通過宿主細胞表面的甘露糖受體促進細菌與吞噬細胞和中性粒細胞之間的相互作用，從而引發對細菌的內吞作用。Fischer等利用fim+和fim-菌株、TLRWT和TLR-小鼠、MyD88WT和MyD88-小鼠，通過尿道感染實驗表明，大腸桿菌的Ⅰ型菌毛通過TLR4和MyD88兩種炎癥反應信號通路蛋白來激發宿主的免疫應答[33]。因此，Ⅰ型菌毛也可以作為一種疫苗為宿主提供有效的保護力。雖然在動物模型中，Ⅰ型菌毛可以引發UTI，但有研究表明，同樣的菌株(E.coli83972)卻不能激發人類泌尿道促炎性反應應答，也幾乎無粘膜黏附能力。這與P菌毛的結果完全相反，但還不能排除Ⅰ型菌毛可能通過其它機制影響細菌的毒力。

3.5與其它黏附因子間互作Ⅰ型菌毛作為細菌的一種表面黏附素，和其它表面黏附因子之間的互作也愈發受到關注。例如，Mobley實驗室對UPEC菌株CFT073和E.coliK12MG1655的Ⅰ型菌毛與鞭毛之間的相互影響的研究結果表明，Ⅰ型菌毛的組成性表達使得鞭毛表達顯著降低，從而抑制了運動性和趨化性，而Ⅰ型菌毛的缺失卻并無增加運動性；反過來，鞭毛的過量表達或是過少也不影響Ⅰ型菌毛的表達量，即它們之間是單向調控的，并且還發現這種協調表達是多基因共同作用的結果。Bar-nich發現大腸桿菌菌株LF82的fliC缺失突變顯著下調了Ⅰ型菌毛的表達，猜測可能是鞭毛調控元件flhDC直接或間接的作用。本實驗室Duan發現將F18+E.coli的fliC缺失后，fimH的轉錄水平上升了近2倍。細菌表面黏附素之間的協同控制是一個復雜的網絡系統，并有待進一步研究。

4總結與展望

Ⅰ型菌毛結構是在電子顯微鏡下觀察到的第一個細胞外非鞭毛絲狀附著物，由染色體編碼，是病原菌的重要致病因子，具有很好的免疫原性。鑒于Ⅰ型菌毛的普遍表型，人們一直忽略了它的致病性，對于其作為毒力因子的重要性沒有一個統一的共識。大多數研究者認為Ⅰ型菌毛是細菌的一個重要毒力因子，它們顯著提高了病原菌對機體的感染率。但也有研究表明，在fim操縱子中插入突變后，接種成年兔的腹膜，與有Ⅰ型菌毛的野生株相比，無Ⅰ型菌毛的突變株能引發更高的死亡率和更快的死亡速度。因此，Ⅰ型菌毛是通過一系列機制改變了腹膜感染的結果。綜合而言，Ⅰ型菌毛在很大程度上影響著細菌對宿主細胞的致病性，但其致病機理仍有待進一步研究。雖然越來越多有關Ⅰ型菌毛的功能與致病性被逐漸發現，但仍有許多未知領域，例如相變開關究竟受哪些因素調控，引發促炎性反應的機理，是否和腸道致病菌的毒力直接相關，能否作為一種安全有效的疫苗投入市場等等，對于Ⅰ型菌毛乃至其它黏附素的探索研究仍任重而道遠。

作者：郭志燕周明旭朱國強單位：揚州大學獸醫學院江蘇省動物重要疫病與人獸共患病防控協同創新中心