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《中國藥理學通報雜志》2016年第一期

摘要：

目的觀察薯蕷皂苷（dioscin，Dio）對大鼠心肌收縮力的影響。方法采用Langendorff逆行主動脈灌流法對大鼠離體心臟進行灌流，利用壓力感受器插管法測定左心室相關心功能參數，記錄低、中和高3個濃度Dio對左心室收縮壓（LVSP）、左心室舒張末期壓（LVEDP）、左心室內壓最大上升／下降速率（±dp／dtmax）的影響。利用激光共聚焦顯微鏡觀察Dio對H9c2細胞內Ca2＋濃度的影響，并利用多功能酶標儀觀察藥物對細胞線粒體膜電位的影響。結果01、1μmol•L－1Dio可明顯增加LVSP，由（1155±052），（1053±028）kPa分別增加至（1308±072），（1253±064）kPa（P＜001）；增加＋dp／dtmax由（038±010）、（040±007）kPa•ms－1分別增加至（042±011）、（043±002）kPa•ms－1（P＜005）。10μmol•L－1Dio則使LVSP由（1213±033）kPa減至（946±077）kPa（P＜001），使＋dp／dtmax由（042±004）kPa•ms－1降為（024±004）kPa•ms－1（P＜001）。01、1、10μmol•L－1的Dio可使H9c2細胞中Ca2＋相對熒光強度由（1662±089）分別增加至（2148±080）、（2568±069）和（1984±066）（P＜001）。01、1μmol•L－1Dio對H9c2細胞線粒體膜電位無明顯影響，而10μmol•L－1Dio會使JC1單體與聚合物的比值由（114±003）增加為（135±006）（P＜001），即引起線粒體膜電位下降。結論低、中濃度Dio可增加LVSP和＋dp／dtmax，表現正性肌力作用，機制為增加細胞內Ca2＋濃度。并且，其在增加細胞內Ca2＋濃度的同時并不會引起鈣超載，僅高濃度出現。

關鍵詞：

薯蕷皂苷；Ca2＋濃度；正性肌力作用；離子通道；鈉鈣交換體；左心室收縮壓

心力衰竭在臨床上可分為急性心力衰竭和慢性心力衰竭［1］，嚴重時可導致意識模糊甚至昏迷，并最終產生心源性休克。同時，心衰所致的電生理重構往往造成心肌動作電位時程延長［2－4］，繼而延長QT間期，這又會增加惡性心律失常發生的風險而誘發猝死等。故隨著人們對其危害性的普遍認知，心衰的防治策略越來越受矚目。目前，臨床上心衰的治療主要是應用地高辛、洋地黃毒苷等具有正性肌力作用的強心苷類藥物［5］，但是其在增加心肌收縮力的同時易引起室早、室速等心律失常，且增加心臟的負擔，而未能改善心衰患者的預后并降低其死亡率［6］。因此，探索更加安全有效的抗心衰藥物仍是今后研究的難點與熱點。

我們發現不少研究［7－10］證實，天然甾體皂苷薯蕷皂苷（dioscin，Dio）具有抗炎、抗腫瘤和抗骨質疏松等多種藥理作用。本室前期實驗研究亦發現Dio對乳鼠心肌細胞缺氧／復氧損傷具有保護效應［11］，而且其在細胞水平可通過調節心肌鈉、鈣等離子通道而發揮抗缺氧／復氧誘導的心律失常作用。更為重要的是，我們前期研究還發現其具備一定的強心作用，且尚未見文獻報道。因此，我們設想與強心苷類同屬于甾體苷類的Dio產生的正性肌力作用是否與其相同？是否比其更低毒更安全？本實驗將進行初步探索，以期揭示Dio作用特點和機制。

1材料與方法

1．1材料

1．1．1實驗對象健康、成年Wistar大鼠，♂，體質量250～300g，合格證號SCXK（京）20120004，由北京維通利華實驗動物技術有限公司提供；大鼠心肌細胞H9c2細胞株，購自中國協和醫科大學基礎醫學研究所細胞中心。

1．1．2藥品與試劑Dio購自國家天然藥物研究中心；JC1和Fluo3AM鈣離子熒光探針購自碧云天生物技術研究所。

1．1．3儀器GL2Langendorff灌流裝置、BL420F生物機能實驗系統，成都泰盟軟件有限公司，中國；PHS3C酸度計，上海精密科學儀器有限公司，中國；Millipore純水系統，美國；OLYMPUS全電動倒置熒光顯微鏡，日本；GeminiXPS熒光讀板機，美國。

1．1．4液體的配制KH灌流液（mmol•L－1）：NaCl11806、KCl469、MgSO4118、CaCl225、NaHCO325、KH2PO4118、Glucose1111，預充混合氧（95％O2＋5％CO2）后調節pH至74。

1．2方法

1．2．1離體心臟Langendorff灌流法用25％烏拉坦麻醉大鼠，仰位固定于鼠臺上，迅速剪開胸腔，暴露心臟，從主動脈根部離斷取心臟，放入4℃生理鹽水中去除脂肪及結締組織。將主動脈逆行插管，以恒溫（37℃）、充氧（95％O2＋5％CO2）的KH液8mL•min－1灌流，灌注壓為8～9kPa左右。待心臟逐漸恢復跳動且殘血排盡后，剪掉左心耳，將球囊壓力感受器探頭經左心房插入左心室。壓力感受器經壓力換能器與BL420生物機能實驗系統相連以記錄左心室收縮曲線，采樣頻率為800點•s－1。心臟灌流穩定30min，給藥前5min作為空白對照，然后給予藥物干預。給藥后20min觀察記錄左心室各項心功能指標。

1．2．2細胞內鈣離子濃度的測定以8×107•L－1的密度將細胞接種于共聚焦培養皿中，于孵箱中培養24h后，與藥液共孵育20min。后加入Fluo3AM工作液負載30min，后用臺氏液洗滌細胞3遍，向各組加入1mL臺氏液，避光孵育20～30min。共聚焦顯微鏡下記錄熒光信號，利用ImageJ軟件計算胞內平均熒光強度。

1．2．3線粒體膜電位的測定以4～5×107•L－1的密度將細胞接種于24孔板，接種48h后用PBS沖洗2遍，給予相應含藥培養基孵育20min。后用PBS沖洗1遍，換上終濃度15mg•L－1JC1孵育20min；孵育完成后，用PBS沖洗2遍，加入DMEM，放入酶標儀檢測熒光值。

1．2．4實驗分組①正常對照組；②低濃度01μmol•L－1Dio組；③中濃度1μmol•L－1Dio組；④高濃度10μmol•L－1Dio組。

1．2．5統計學分析數據以珋x±s表示，采用SPSS210軟件進行配對t檢驗和單因素方差分析，方差齊時，多組間比較用LSD法；方差不齊時，采用DunnettT3法。

2結果

2．1Dio對大鼠離體心臟左心室各心功能指標的影響以給藥前5min作為正常對照，采用配對t檢驗比較各組給藥前后各心功能指標差異。由BL420系統記錄到的左心室壓力圖像（Fig1）。01μmol•L－1和1μmol•L－1Dio使LVSP明顯增加近13％和18％（P＜001）；＋dp／dtmax增加約11％和9％（P＜005），同時HR減慢；10μmol•L－1Dio則使LVEDP明顯增加（P＜001），而LVSP等其他指標均明顯降低（P＜001），且實驗過程中偶見心律失常。各濃度Dio下參數具體變化見Fig2中給藥后各參數與正常對照的比值。

2．2Dio對大鼠心肌細胞內鈣離子濃度的影響Dio作用后Ca2＋熒光強度變化如Fig3和Fig4所示。與正常對照組相比，01、1和10μmol•L－1Dio均能使熒光強度增強（P＜001），其中1μmol•L－1Dio效應最明顯，使熒光強度增加約5625％。

2．3Dio對大鼠心肌細胞線粒體膜電位的影響Dio作用后熒光比值變化如Fig5所示。與正常對照組相比，01、1μmol•L－1Dio孵育均未引起熒光比值明顯變化（P＞005）。但10μmol•L－1Dio使該比值增加約1842％（P＜001），顯示該組線粒體膜電位降低。

3討論

本實驗分別探索了Dio對心肌收縮力和細胞內Ca2＋濃度的作用，低、中濃度Dio可使LVSP和＋dp／dtmax明顯增加，體現正性肌力作用。研究證實，舒張性心力衰竭患者，左室射血分數正常而－dp／dtmax明顯降低。Dio可增加－dp／dtmax，在一定程度上改善左心室舒張功能，相較于傳統的正性肌力藥更有優勢。然而，高濃度Dio對心肌收縮力的作用卻與低、中濃度相反，使LVSP和±dp／dtmax均減小，僅增加LVEDP。在實驗過程中，在剛剛給予高濃度Dio時（5min內），可觀察到LVSP有所增加，但隨著灌流時間的延長，LVSP開始降低，甚至出現心律失常，這可能與高濃度Dio過分增加LVEDP，使得容量負荷過度有關。心肌收縮功能與細胞內Ca2＋水平密切相關［12－13］。我們由當前研究發現Dio的急性作用可使Ca2＋熒光強度增強，這表明Dio與洋地黃強心苷類藥物作用方式相似，即通過增加心肌細胞內Ca2＋濃度而發揮正性肌力作用。這引發了我們對于Dio在提升細胞內Ca2＋水平的同時是否會導致鈣超載，以及其誘導Ca2＋濃度增加的機制產生了思考。

首先，線粒體膜電位的測定結果顯示，低、中濃度Dio對熒光比值無明顯改變，即不由此引發細胞損傷。同時，其僅在10倍于中濃度的高濃度下才使該比值有一定升高，這與離體水平上高濃度的不良效果較為一致。但是與洋地黃毒苷類強心藥易引發心律失常，增加心臟負荷相比，Dio似乎仍顯示出更優的安全性，因為在1μmol•L－1濃度時，Dio增加細胞內Ca2＋濃度和心肌收縮力在本實驗中最明顯，而此時并未見心律失常以及鈣超載所致的線粒體膜電位下降，顯示出Dio在發揮正性肌力作用上可能具備一定優勢。

其次，細胞內Ca2＋濃度的增加表明Dio并非如左西孟坦等鈣增敏劑，通過增加心肌收縮蛋白對Ca2＋的敏感性來發揮強心作用［14］。另外，我們前期實驗又證實Dio可減少L型Ca2＋通道介導的內向鈣電流［15］，這表明L型Ca2＋通道不是Dio增加Ca2＋濃度的途徑。因此，其機制有待于進一步研究。再有，我們前期結果還顯示Dio能夠增加內向鈉電流［16］。聯想到臨床上使用的洋地黃類藥物通過抑制心肌Na＋K＋ATP酶活性，使細胞內Na＋增多，從而通過鈉鈣交換體（sodiumcalciumexchanger，NCX）使細胞Ca2＋內流增加，產生正性肌力作用［17］。Flesch等［18］也認為，鈉通道激活劑產生正性肌力作用的機制與鈉鈣交換活動增強有關。另外，進入細胞的Ca2＋也可觸發肌漿網釋放Ca2＋［19］。我們據此推測，Dio增強心肌收縮力的作用可能與影響鈉鈣交換體相關。因此，下一步我們將觀察Dio是否通過上述機制增加胞內Ca2＋濃度以證明我們的設想。

總之，我們證實Dio通過增加胞內Ca2＋濃度產生正性肌力作用，還能改善舒張功能，僅高濃度時才產生一定的鈣超載，基本符合理想正性肌力藥的要求［20］。當然，本實驗目前僅初步發現Dio的正性肌力作用，還尚未對其作用原理進行深入探究，故今后我們將從多途徑，如NCX電流以及進出肌漿網的Ca2＋濃度變化等進行觀察以闡明其機制。同時，Dio對病理情況下心肌收縮力的作用也亟待探索。

作者：韓鈺 楊帆 叢恬鈔 孫凱 李燕 康毅 尹永強 婁建石 單位：天津醫科大學基礎醫學院藥理學教研室