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摘要：轉錄因子ZHX2(zinc-fingerandhomeoboxes2)是ZHX家族成員,是新近發現的腫瘤抑制因子.zhx2通過抑制細胞增殖和遷移以及耐藥相關基因表達抑制肝細胞肝癌等多種腫瘤的進展.最新研究報道,ZHX2通過促進NF-κB激活,促進腎細胞腎癌的發生,強烈提示ZHX2在不同腫瘤中發揮不同作用,值得深入研究.另外,ZHX2還參與病毒感染、代謝調節、發育及其他多種重要病理生理過程.本文主要綜述ZHX2的結構特征及其在腫瘤等重要疾病中的作用和機制,并介紹ZHX2的表達調控機制,以期為ZHX2的深入研究和臨床應用提供理論依據.

關鍵詞：ZHX2;肝癌;發育;病毒感染;代謝;轉錄調控

1ZHX2的結構特征與功能

ZHX家族包括ZHX1,ZHX2和ZHX33個成員.1998年,研究者在人腦組織cDNA文庫中鑒定了ZHX2的cDNA(KIAA0854)序列,其全長為4.5kb[12].2003年,日本學者Kawata等人[13]首次克隆人ZHX2基因.人ZHX2基因定位于染色體8q24.13,包含4個外顯子,編碼837個氨基酸殘基的蛋白,包括2個C2H2的鋅指結構域(zincfinger,Znf)和5個同源框蛋白結構域(homeodo-main,HD),并且在HD1和HD2之間的408~448位存在富含脯氨酸殘基的結構域(prolinerichregion,PRR)[13].人和小鼠ZHX2蛋白同源性高達87%.ZHX2廣泛表達于卵巢、腦、心、肝、腎、肺和脾臟等組織和器官,并主要定位于細胞核中發揮轉錄抑制作用[12].ZHX2既可以與核因子-YA亞基(nuclearfactorYA,NF-YA)相互作用,抑制下游靶基因的表達,也能夠形成同源二聚體,或與同家族成員ZHX1,ZHX3形成異源二聚體,發揮轉錄抑制功能[2~4,14].ZHX2通過其HD1-HD2結構域與NF-YA結合.ZHX2的242~446區包含PRR和HD1,是同源二聚化功能域,并決定ZHX2核定位和轉錄活性[5,13].

2ZHX2調控腫瘤等多種病理生理過程

ZHX2最初作為AFP表達的負調控基因被發現[1,2],隨后在肝細胞肝癌中證實其抑癌基因作用[5],從而引起更為廣泛的關注.肝癌組織中ZHX2核表達明顯降低,且與腫瘤分化程度顯著正相關[5].ZHX2異常表達還與B細胞淋巴瘤、骨髓瘤、肺癌、胃癌、乳腺癌的惡性程度和不良預后密切相關[6,7],提示ZHX2在腫瘤發生發展中發揮重要作用.除此之外,ZHX2也被發現參與病毒感染、腎病綜合癥和心血管疾病等多種疾病的發生發展,并與細胞發育和脂質代謝等生理過程密切相關[11,15~18].總之,ZHX2參與多種病理生理過程.

2.1ZHX2調控肝細胞肝癌等多種腫瘤的發生

ZHX2的表達與肝細胞肝癌等多種腫瘤相關.早期研究發現,ZHX2導致不同品系小鼠血清中AFP的表達存在明顯差異[1].ZHX2不但抑制成年小鼠血清中AFP的表達[2],并且在肝癌患者中與AFP表達負相關[19,20].肝癌組織中ZHX2啟動子存在明顯的甲基化,導致ZHX2表達下調[20].臨床研究證實,ZHX2核表達與病人的生存期正相關[5].除肝細胞肝癌外,多發性骨髓瘤(multiplemelanoma,MM)中ZHX2表達下調,并且與腫瘤的增殖和浸潤負相關[6,9,21,22].此外,ZHX2也是霍奇金淋巴瘤(Hodgkinlymphoma)的潛在抑癌基因[23].與上述研究不同,最新研究發現,腎癌中ZHX2核表達升高并促進腫瘤的生長和遷移[24].因此,ZHX2異常表達與多種腫瘤相關,并且在不同的腫瘤中發揮不同作用.深入研究ZHX2在不同腫瘤中的作用和機制,揭示ZHX2的新靶基因,將為腫瘤診斷和治療提供重要幫助.(1)ZHX2作為抑癌基因抑制肝細胞肝癌及其他腫瘤的機制.(a)ZHX2抑制HBV病毒復制.肝癌危險因素眾多,包括病毒感染、過度飲酒、肝硬化和非酒精性脂肪肝等,其中HBV慢性感染是誘發肝細胞肝癌的重要因素[25].首先,HBV病毒基因組可以整合到宿主DNA中,進而導致宿主細胞原癌基因和抑癌基因的異常表達.并且,HBV病毒表達的HBx,HBc和HBs等蛋白能夠促進肝癌細胞的增殖和遷移.另外,HBV病毒感染引起肝臟的炎癥反應也是導致肝細胞肝癌的重要因素[26,27].最新的研究表明,ZHX2調節HBV復制,可能是ZHX2調節肝細胞肝癌發生的重要機制.本實驗室研究發現,ZHX2結合HBVcccDNA(covalentlyclosedcircularDNA),并抑制HBV啟動子活性,從而抑制HBV復制.此外,ZHX2轉錄抑制組蛋白乙酰化酶p300和CBP的表達,影響cccDNA表觀修飾,抑制HBV的復制[28].ZHX2可能通過降低肝細胞中HBV病毒載量,減少HBV病毒在宿主DNA中整合,進而抑制肝細胞肝癌的進展.體內外實驗證實,ZHX2顯著抑制HBc,HBs和HBe表達[28],而過表達ZHX2可以消除HBx介導的肝癌細胞惡性增殖[29],進一步證實ZHX2抑制HBV是其發揮肝癌抑癌基因作用的重要機制.(b)ZHX2調節脂質代謝.越來越多的研究證實,肝臟脂質代謝異常導致的脂肪肝是肝癌的重要危險因素[30].肝臟內甘油三酯累積和脂質的氧化磷酸化,誘導肝細胞的氧化應激反應,導致肝纖維化和肝炎,最終誘發肝細胞肝癌[31].對血脂水平不同的相近品系小鼠的研究發現,ZHX2突變與小鼠血脂異常密切相關,ZHX2轉基因鼠血漿膽固醇及甘油三酯水平顯著升高[32].進一步研究發現,ZHX2調控脂質代謝相關的P450和LPL基因的表達.P450酶調控類固醇相關的激素、脂肪酸、藥物和外界化學物質等的代謝[33].最新研究報道,ZHX2抑制雌性相關的P450基因在成年雄性小鼠肝臟中的表達.在雄性小鼠的肝臟細胞中條件性敲除ZHX2基因,Cyp2a4等雌性相關P450基因表達顯著增強[32].脂蛋白脂肪酶(lipoproteinlipase,LPL)是調節脂蛋白代謝的重要基因.2010年,研究者在小鼠中發現ZHX2基因與LPL的表達負相關[15],提示ZHX2可能通過LPL直接參與肝臟的脂質代謝.因此,ZHX2可能通過調控肝臟中脂質代謝的穩態,進而抑制肝細胞肝癌的進展.(c)ZHX2抑制細胞增殖、遷移和耐藥.細胞惡性增殖、遷移和耐藥是腫瘤細胞的重要生物學特性.目前研究發現,ZHX2能夠下調與細胞增殖、遷移和耐藥相關的多個基因和通路,如AFP,GPC3和CyclinE等.因此,ZHX2可能通過調控上述腫瘤相關基因抑制肝癌細胞的增殖和遷移及耐藥,最終抑制肝細胞肝癌的發生發展.

首先,AFP,GPC3和CyclinE是調控肝癌細胞增殖的關鍵基因,ZHX2在轉錄水平上抑制這些基因的表達[3~5].AFP對肝癌細胞的促進作用尤為明顯,研究表明肝癌細胞系BEL-7402和HepG2在AFP作用下生長明顯加快[34,35].此外,ZHX2可以與轉錄因子NF-YA結合并轉錄抑制NF-YA靶基因[13].NF-YA調節腫瘤相關Wnt信號通路關鍵基因c-myc的表達[36],提示ZHX2可能通過NF-YA調控Wnt信號,進而參與肝細胞肝癌的發生發展.GPC3除了能夠促進細胞的增殖,還在肝癌細胞遷移過程中發揮重要作用[37].因而,ZHX2下調GPC3表達,不僅抑制肝癌細胞的增殖,還可能抑制肝癌細胞的遷移.與此對應,ZHX2通過NF-YA調節細胞遷移相關基因TIMP-2的表達[38],再次提示ZHX2可能影響肝癌細胞的遷移過程,但ZHX2對腫瘤侵襲轉移的影響及具體機制尚待進一步研究.腫瘤細胞耐藥是腫瘤復發和難治的重要原因,肝癌耐藥尤為嚴重.MDR1(multidrugresistance-1)在肝癌等眾多腫瘤多藥耐藥性產生中發揮重要作用,其編碼的P-gp蛋白是一個能量依賴的分子泵,可以降低細胞內藥物的濃度表達,從而降低藥物治療的效果[39].ZHX2在轉錄水平上下調MDR1的表達,進而增強肝癌細胞對順鉑等化療藥物的敏感性[14].ZHX2對腫瘤耐藥的影響同樣在骨髓瘤研究中得到了證實[22].另外,腫瘤干細胞通過調節腫瘤微環境、ABC轉運蛋白表達和DNA損傷修復功能等對各種化療藥物耐受[40].研究表明,ZHX2抑制牙乳頭根尖干細胞的增殖[41],并且ZHX2在神經干細胞功能的維持和B細胞發育的過程中發揮功能[11,17].上述研究提示ZHX2具有通過調節腫瘤干細胞影響腫瘤耐藥性的潛能.(d)ZHX2影響免疫微環境.免疫微環境是腫瘤研究的熱點.腫瘤細胞通過下調腫瘤特異性抗原表達、介導免疫細胞凋亡和誘導免疫抑制性細胞產生等方式逃避免疫監視.此外,腫瘤細胞還可以通過多種機制重塑浸潤的免疫細胞,使其發揮促進腫瘤生長的功能[42].腫瘤相關巨噬細胞是由腫瘤微環境中含量最豐富的免疫細胞組成,備受關注.腫瘤相關巨噬細胞通過分泌不同因子促進腫瘤進展中的多種重要生物學過程,包括腫瘤生長、腫瘤遷移、血管形成和腫瘤浸潤等[43].最新研究發現,ZHX2缺失小鼠巨噬細胞凋亡數量增加,并且分泌M2相關細胞因子明顯增多[44],提示ZHX2影響巨噬細胞的增殖和分化.因此推測ZHX2可能調控腫瘤相關巨噬細胞的功能、參與肝細胞肝癌等腫瘤的發生發展.另外,研究表明腫瘤浸潤的B淋巴細胞與腫瘤良好的預后相關.然而,與巨噬細胞類似,B淋巴細胞同樣具有不同的亞型,腫瘤微環境中不同亞型B淋巴細胞的平衡最終決定其在腫瘤發生中的功能[45].研究發現ZHX2在B細胞發育早期表達,隨后其表達下降[17],提示ZHX2參與B細胞發育,可能與B細胞的分化及功能相關.此外,ZHX2表達譜分析顯示,ZHX2在脾臟、胸腺等免疫器官表達豐富[12],ZHX2是否影響不同免疫細胞的發育與功能,進而參與腫瘤免疫微環境重塑,值得深入研究.(2)ZHX2作為癌基因促進腎癌的機制.ZHX2自克隆以來,其作為轉錄因子抑制多種腫瘤相關基因,在肝癌、骨髓瘤等不同腫瘤中發揮抑癌基因作用.然而,2018年Science發表文章,報道腎細胞腎癌中抑癌基因VHL(vonHippel-Lindau)缺失導致ZHX2蛋白在細胞核中累積.進一步研究證實,E3酶VHL能夠介導脯氨酸羥基化的ZHX2泛素化降解.腫瘤標本中也證實VHL的缺失增加ZHX2在腎癌細胞核中的表達.通過ChIP-seq和基因芯片研究發現,ZHX2結合基因啟動子區的H3K4me3和H3K27ac顯著增加,提示ZHX2激活靶基因的啟動子活性.因此,ZHX2通過表觀遺傳修飾激活NF-κB信號通路,促進腫瘤的生長和遷移[24].該研究不僅證實ZHX2存在有羥基化修飾和泛素化降解途徑,并且提出了ZHX2具有癌基因功能,強烈提示,ZHX2在不同腫瘤中發揮不同的功能[46].ZHX2在多種組織廣譜表達,深入研究ZHX2在不同腫瘤中的作用及其機制具有重要意義.

2.2ZHX2的其他病理生理功能

神經細胞和B細胞發育的過程中都檢測到ZHX2表達變化[11,17],提示ZHX2參與細胞發育.ZHX2調控神經細胞發育及干性維持可能與其結合Epherin-B蛋白有關,但目前ZHX2影響發育的具體機制尚未闡明.除了參與機體正常的生理功能,ZHX2還與多種病理過程相關.研究報道,ZHX2表達異常與腎病綜合癥、心血管疾病、代謝相關疾病、遺傳性胎兒血紅蛋白持續存在綜合癥和α,β-地中海貧血相關[6,18,21,47,48].然而,ZHX2參與上述病理過程的具體作用機制尚不明確.因此,明確ZHX2在不同疾病中的作用及機制,將為疾病的診斷和治療提供更有價值的信息.

3ZHX2的表達調控

ZHX2參與多種重要的病理生理過程,其表達調控可能是多種疾病發生的重要原因.為此,深入研究ZHX2的表達調控將為不同疾病治療提供新靶點.然而,目前對于ZHX2表達調控的研究仍相對缺乏.本部分將從表觀遺傳水平、轉錄水平、轉錄后水平和蛋白水平綜述ZHX2表達調控的研究進展.

3.1表觀遺傳水平調控

表觀遺傳修飾在不改變基因編碼序列的情況下調控基因表達,常見的表觀遺傳修飾包括DNA甲基化和組蛋白乙酰化等.DNA甲基化是在DNA甲基轉移酶(DNAmethyltransferase,DNMT)的作用下,在DNA序列中富含CpG島的C的第5位碳原子上加入一個甲基基團,形成5-甲基胞嘧啶(5mC),DNA甲基化修飾能夠沉默基因表達,是多種抑癌基因表達異常的重要機制[49].Lv等人[20]通過甲基化敏感的限制性指紋(methy-lation-sensitiverestrictionfingerprinting,MRSF)的方法檢測發現,肝癌組織中ZHX2的啟動子甲基化水平明顯高于癌旁組織,導致肝癌ZHX2基因表達顯著降低,而甲基化抑制劑5-AZA-DC處理肝癌細胞可以誘導ZHX2高表達.DNMT1和DNMT3A等甲基轉移酶在肝癌組織中表達上調[49],推測甲基轉移酶通過抑制ZHX2的表達促進腫瘤的進展.腫瘤中抑癌基因組蛋白去乙酰化是抑癌基因沉默的重要調控機制,p53是其中的典型代表.過表達組蛋白去乙酰化酶(histonedeacetylases,HDACs)顯著抑制細胞中p53的轉錄活性[50].HDACs在多發性骨髓瘤、霍奇森淋巴瘤、B細胞淋巴瘤和急性粒細胞瘤,特別是在肝癌中表達明顯升高[51].ZHX2基因組蛋白去乙酰化是其在肝細胞肝癌中表達下調的重要潛在調控機制,但迄今尚無明確報道.目前組蛋白乙酰化酶抑制劑NCT00873002、NCT01075113和NCT00823290等已在歐美國家進入肝癌治療的臨床實驗階段[51].因此,深入研究ZHX2基因組蛋白乙酰化修飾具有重要的臨床意義.

3.2轉錄水平的調控真核生物基因

在轉錄水平上存在復雜的調控機制,這一調控由眾多的轉錄激活因子、轉錄抑制因子、輔助轉錄因子及其他特異性因子形成的轉錄復合體完成.研究者以巨噬細胞系THP1為模型,利用計算生物學方法研究發現ZHX2是受到高度調節的轉錄調控因子,有151個潛在的轉錄因子調控ZHX2表達[52].體外細胞實驗證明,多種因子在轉錄水平上調節ZHX2的表達.在Hodgkinlymphoma(HL)細胞中過表達MSX1和XBP1能夠上調ZHX2的表達,MSX1的共抑制因子H1C能夠抑制MSX1對ZHX2的激活作用,最終抑制ZHX2在HL細胞中的表達.此外,FOXC1在HL患者和HL細胞系中高表達.FOXC1的高表達不僅能夠抑制ZHX2轉錄激活因子MSX1,并且通過IPO7蛋白促進ZHX2轉錄抑制因子H1C向細胞核的轉運,最終降低抑癌基因ZHX2的表達[7].上述研究表明,在HL細胞中ZHX2基因在轉錄水平上受到調控,推測肝癌和其他腫瘤中存在相似的調控機制.

3.3轉錄后水平的調控

轉錄后水平的調控,主要是指對基因轉錄的RNA進行加工修飾的過程.MicroRNAs(miRNAs)在基因轉錄后調控中起到重要作用.miRNAs是一類長約20個核苷酸的小RNA分子,由RNA聚合酶Π/Ш轉錄合成,并經過Drosha和Dicer酶加工成熟.成熟后的miRNAs能夠結合靶基因的mRNA,誘導靶基因mRNA的降解,進而在轉錄后水平調控靶基因表達[53].本實驗室的最新研究表明,HBV特別是HBx蛋白能夠在肝癌細胞中誘導miR-155表達上調,miR-155與ZHX2的3′UTR區結合,在轉錄后水平上抑制ZHX2的表達[29].Zhou等人[54]在研究HBV促進肝癌的機制時發現,HBx能夠上調miR-3188的表達,miR-3188靶向ZHX2的mRNA,在轉錄后水平抑制ZHX2的表達促進肝癌的進展.腫瘤細胞中眾多miRNAs表達異常,除了最近報道的miR-155和miR-3188,腫瘤中表達上調的其他miRNAs存在靶向ZHX2的可能.近年來,RNA甲基化修飾(m6A)引起研究者的極大興趣.m6ARNA甲基化修飾參與RNA生命周期的各個過程,包括RNA的合成、RNA的出核、RNA的翻譯及RNA的降解.研究證實,m6ARNA甲基化修飾通過多種機制參與腫瘤的啟始和進展過程[55].ZHX2在肝細胞肝癌發生過程中表達異常,ZHX2的mRNA是否存在m6A甲基化修飾異常,值得進一步深入研究.

3.4蛋白水平的修飾

蛋白質修飾包括磷酸化、乙酰化、泛素化、甲基化和糖基化等,影響蛋白質的穩定性及其功能.腫瘤抑制因子p53蛋白有多達50個氨基酸殘基是潛在的修飾位點.p53蛋白的乙酰化修飾促進其核內轉運,增強p53轉錄激活作用.而由泛素化酶MDM2介導的p53蛋白泛素化,引起p53蛋白降解,進而喪失腫瘤抑制作用[56].最新研究證明,ZHX2同樣存在蛋白水平的修飾.在腎癌細胞中,ZHX2蛋白第427、440和464位脯氨酸殘基存在羥基化修飾.羥基化修飾的ZHX2能與E3泛素酶VHL結合,進而上調ZHX2的泛素化導致ZHX2蛋白的降解[24].肝細胞肝癌發生過程中,ZHX2蛋白在細胞核中的表達明顯降低[5].蛋白乙酰化修飾影響p53蛋白的核定位,ZHX2蛋白是否存在相似的調控機制有待進一步深入研究.ZHX2蛋白存在甲基化、磷酸化和糖基化等修飾的可能,并影響ZHX2的生物學功能.

4展望

目前,眾多的研究表明,ZHX2與腫瘤等多種疾病的發生發展密切相關,但現有研究主要關注ZHX2對腫瘤細胞或實質細胞的影響.早期研究發現,ZHX2參與B細胞的發育過程,提示ZHX2具有參與免疫調節的潛能,探究ZHX2在淋巴細胞發育和腫瘤免疫中的作用將是未來研究的重要方向.此外,在多種疾病過程中發現ZHX2異常表達,特別是肝癌中,ZHX2發生明顯的胞漿轉位現象,但其機制尚不清楚.最新的髓系細胞生物信息學研究提示ZHX2是表達調控網絡的關鍵分子之一,受到精確的調控以避免細胞調控網絡的混亂,并且預測了151個ZHX2的調控因子和292個受ZHX2調節的轉錄因子.然而,有關ZHX2的表達調控的實驗研究相對缺乏.已有報道啟動子甲基化導致肝癌中ZHX2表達下調,揭示疾病發生過程中ZHX2的表觀修飾及翻譯后修飾的改變可能是解析ZHX2表達和功能異常的重要途徑.總之,目前對ZHX2功能和調控機制研究甚少,有眾多的問題亟待解決.隨著研究的深入,明確ZHX2在各種疾病中的作用,闡明ZHX2表達調控的網絡,將為疾病的診斷和治療提供新的思路和方法.

作者：岳學田；武專昌；馬春紅 單位：山東大學基礎醫學院醫學免疫學系