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1基因芯片技術概述

1.1基因芯片的分類。

1.1.1按儲存的生物信息類型分類寡核苷酸芯片、cDNA芯片、PCR擴增子探針芯片,這是最常用的分類方法。寡核苷酸芯片探針長度較短,一般為幾十個堿基,是通過采集已知基因組序列,經過特殊的探針設計和分析軟件篩選,用DNA合成儀人工合成,常用于基因分型和突變檢測;cDNA芯片是通過逆轉錄獲得基因的編碼區片段制備成的芯片,主要用于基因表達分析;PCR擴增子探針芯片是通過分析已經測序的目標基因組上的保守或特征性的基因或DN段,設計擴增引物,進行PCR擴增,將獲得的長度為幾百至上千個堿基左右的擴增子作為芯片探針,常用于基因表達的分析。1.1.2按應用不同分類可分為表達譜芯片、診斷芯片、檢測芯片。1.1.3按基片的性質分類可分為有機芯片(聚內烯膜、硝酸纖維素膜、尼龍膜)和無機芯片(玻璃、硅片、陶瓷)。1.1.4按材質和功能分元件型微陣列芯片、通道型微陣列芯片、生物傳感芯片。近年來,基因芯片技術應用于miRNA(microRNA)的研究有了重要突破[4,5]。miRNA是一些長度為22個核苷酸左右的非編碼調控RNA家族。miRNA具有同源性、保守性及特異性等特點,通過影響蛋白質的合成參與調節生物細胞的發育。但是,miRNA只是總RNA樣本中的一小部分,只能為添加標記或設計探針提供很少的序列,用高特異性來標記比較困難。同時,miRNA以3種方式存在:小的成熟miRNA、發夾狀的miRNA前體、長的miRNA前體。只有成熟的miRNA是有活性的,因此,需要剔除miRNA前體。用標準的芯片程序去分析miRNA比較困難。

1.2基因芯片制備分析方法。

1.2.1雜交樣品一般從樣品細胞和對照細胞中提取。1.2.2cDNA微陣列探針制備提取的mRNA通過反轉錄得到更穩定的cDNA,分別對樣品細胞和對照細胞中加入不同熒光染料(Cy3,Cy5)進行標記。1.2.3雜交試驗2種樣品同時雜交到制作好的芯片上,芯片上每個點都與分別標記有2種不同熒光的樣品競爭結合。1.2.4掃描與雜交結果分析通過激光掃描儀獲得每個點Cy3與Cy5的熒光強度,用軟件分析其熒光強度值并計算Cy3與Cy5的比值。2個熒光信號的強度代表2種標記探針的相對數量,比值代表該點對應基因的mRNA在2種細胞中的表達豐度。1.2.5微陣列系統核實與差異表達基因判定實驗中設置陰性、陽性對照點,以確保整個微陣列系統雜交結果的可信度,重復實驗以降低假陽性率;差異基因的判定標準為Cy3與Cy5的比值在0.5~2.0之間。

1.3基因芯片技術的應用領域。

1.3.1臨床疾病診斷?；蛐酒夹g可以對遺傳信息進行準確分析,快速找出差異基因,因此它在疾病診斷方面發揮著越來越重要的作用[6,7]。1.3.2藥物篩選和新藥開發。用基因芯片技術確立了疾病組與對照組相關基因表達的差異情況后,就可針對疾病發生機制進行藥物篩選:將這些差異基因固定在芯片上,研究病變組織和正常組織在某種藥物刺激下這些基因表達的變化,從而判斷藥物治療的效果,并通過高通量篩選,為新藥的開發提供一種高速、高敏的方法。1.3.3DNA測序。將已經被熒光標記的待測DNA樣品與設計在基因芯片上的已知序列片段雜交,若兩者完全配對,則雜交信號較強,若有一個或幾個堿基不配對,則信號較弱。目前基因芯片在DNA測序方面的應用主要是用于已知序列的重測序[4]。1.3.4環境科學領域?；蛐酒梢钥焖贆z測污染微生物或有機化合物對環境、人體、動植物的污染和危害,同時也可以采用毒物檢測芯片對環境中眾多化學物質對人類基因的潛在毒性進行篩選,探測毒物開啟或關閉哪些基因,制備防治危害的基因工程藥物,或尋找能夠治理污染源的基因產品[8]。另一方面,基因芯片技術在病毒檢測、勞動衛生學、食品衛生學、農林畜牧業也發揮越來越大的作用[9,10]。1.3.5轉基因食品安全性的應用。將特異片段制成檢測芯片,與待測產品的DNA進行雜交,就可以判斷待測樣品是否為轉基因產品,該技術不僅可對轉基因食品進行定性檢測,還可以定量檢測。

2基因芯片技術在男性生殖醫學研究中的應用

基因芯片技術在男性生殖醫學研究和臨床應用中具有廣泛的前景[1,2,7]。目前,主要見于精子發生基因研究、精子功能研究、生殖毒理研究以及男性不育的診斷和治療的研究。

2.1在精子發生基因研究中的應用精子發生是一個獨特復雜的細胞分化過程,其表達受嚴格的時間和空間調節,任何影響精子發生的因素都可能導致精子發生異常。因此精子發生的基因研究是生殖生物學領域中的一個重要課題。Tang等應用基因芯片篩檢Balb/c小鼠出生后不同時期睪丸的cDNA文庫[11],結果表明ACRV1在出生后35d、54d和6個月的小鼠睪丸中表達,而在4d、9d和18d的小鼠睪丸中未表達,并確定ACRV1僅在小鼠出生后35d的睪丸組織中特異表達。通過熒光免疫檢驗法和免疫組織化學染色顯示[11],人類ACRV1蛋白主要位于睪丸的圓形精子細胞和長形精子細胞中,表明ACRV1在哺乳動物的精子發生過程中起著重要作用,并且可能會成為避孕疫苗的靶點。近年來相關研究報道[12-17],利用基因芯片技術發現了NYD-SP12、NYD-SP6、NYD-SP9、NYD-SP16、Rtn-T、CLGN等睪丸表達基因,這些基因編碼的蛋白都與精子的發生密切相關。Sha等應用cDNA微陣列技術篩查成人和胎兒睪丸組織的基因表達[18],發現一種新的睪丸特異基因TSP1,蛋白分析顯示其包含N-末端的bHLH和C-末端的Zip的2個功能區域,在成人睪丸中高表達,提示對人精子發生發揮重要作用。Zhou等利用同樣的研究方法發現了一種新的基因TSG23/Tsg23[19],并通過RT-PCR、原位雜交、蛋白質印跡及免疫組織化學等方法驗證了TSG23/Tsg23主要位于睪丸組織。此作者還比較了正常生育男性和無精子癥患者睪丸中TSG23的表達,結果顯示,梗阻性無精子癥患者睪丸中TSG23的表達少于正常生育力男性,而在非梗阻性無精子癥中則無表達。因此TSG23/Tsg23可以為無精子癥的診斷和分類提供參考,也預示著TSG23/Tsg23與人精子發生有關。當精子發生基因出現突變或表達異常,或調控的時間及空間異常,就可能導致少精子癥,甚至無精子癥。

應用基因芯片技術,可以對無精子癥、少精子癥進行分子病因學診斷,并可以進行大樣本快速準確的遺傳學篩查。Y染色體上存在大量與精子發生相關的基因,其中在其長臂非熒光區域(Yq11,23)有一個無精子因子(azoospermiafactor,AZF)基因位點,由于該基因缺失患者多數表現為無精子癥,所以稱為AZF基因[20]。AZF基因缺失導致男性不育的遺傳因素中排第2位,僅次于Klinefelter綜合征,AZF分為AZFa、AZFb、AZFc、AZFd等4個區域,其中以AZFc的缺失較多見(60%)[21-23]。Zhu等對中國178例非梗阻性無精子癥、134例少精子癥不育男性和40例正常生育男性進行Y染色體檢測[24],結果顯示11.5%(36/312)不育患者中存在Y染色體微缺失,其中AZFc微缺失所占比例最大(52.8%);正常生育男性中未檢測到Y染色體微缺失。目前檢測Y染色體微缺失的技術靈敏、高效,建議對此類患者在實施輔助生殖技術前進行Y染色體遺傳學篩查。cDNA微陣列技術可以應用于篩選非梗阻性無精子癥相關基因的研究。Lin等通過cDNA微陣列技術篩查9例生精功能正常者和15例精子成熟障礙或唯支持細胞綜合征患者的睪丸組織樣本[25],結果后者共有300個基因顯著下調,并且證實其中10個是與生育相關的新基因(Hs.126780、Hs.553658、Hs.274135、Hs.268122、Hs.531701、Hs.171130、Hs.351582、Hs.407480、Hs.552781、Hs.355570),大部分新基因在鼠和人類睪丸中的表達是特異性的,將為人類精子發生的研究提供新途徑和方向。楊波等應用微陣列芯片對10例正常人睪丸及39例非梗阻性無精子癥睪丸組織中差異表達基因譜進行了研究[26],獲得128個可能與無精子癥相關的差異表達基因,其中56個基因表達上調,72個基因表達下調,COX10下調明顯,原位雜交技術結果與cDNA微陣列雜交相同,說明COX10可能在無精子癥的發生與進展過程中起重要作用。楊波等還應用基因芯片技術研究了RAP1A、鈣黏附分子CDH18、PCDH17、細胞周期類分子在人無精子癥患者和正常生育男性睪丸中的差異表達[27-29],結果表明這些基因可能與睪丸精子發生和無精子癥存在相關性。Lian等通過微陣列技術比較非梗阻性無精子癥(non-obstructiveazoospermia,NOA)患者和正常生育力男性睪丸組織中miRNA的表達譜[30],結果表明,NOA患者有154個miRNA表達上調和19個表達下調,這些表達異常的miRNA通過RT-PCR進行了驗證,包括miR-302a、miR-491-3p、miR-520d-3p和miR-383。

2.2在精子功能研究中的應用精子發生的基因突變或表達異常,也可能導致精子的功能異常,發生弱精子癥,甚至死精子癥。Yap等使用RNA原位雜交表明[31],MII5表達于鼠的生殖細胞中,同時通過電子顯微鏡、視頻顯微鏡和體外受精等技術證實,缺失MII5的鼠其精子成熟末期和包裝存在缺陷,這與MII5的表達一致,這些缺陷包括頂體帽的分離和過多殘余胞質,導致精子功能異常,前向運動精子數減少。這些缺陷通過體外受精無法改善,基因芯片技術分析結果表明,MII5轉錄產物與精子發生有關。Montjean等收集男性不育患者和正常生育男性的精液樣本[32],經非連續密度梯度離心法分離出精子,基因芯片技術分析表明,在精子樣本中探查到5382個基因,少精子癥不育組和正常生育組的精子轉錄表達具有高度同源性。另外,與正常生育組相比,有157個轉錄基因在不育組中表現為上調或下調,這些差異基因涉及一系列的生物過程和分子功能,下調至少2倍的調節基因在不育患者生殖細胞中占大約83%,其中涉及精子發生、精子活力、生殖細胞抗凋亡程序的基因(PRM2,SPZ-1,SPATA-4,MEA-1,CREM)下調高達42.96倍;表達下調的基因還涉及DNA修復(NIPBL)、氧化應激調控(PARK7)和組蛋白修飾(DDX3X,JMJD1A)。李如凱等應用基因芯片技術將純化的精子cDNA探針與Affyme-trix全基因組芯片雜交[33],結果C14orf48基因在弱精子癥患者精子中不表達,此外對人的8種組織(心、肝、脾、肺、腎、胃、腦、睪丸)進行C14orf48檢測,結果C14orf48只在睪丸組織中表達。研究結果提示[33],C14orf48基因為睪丸特異性表達基因,其在弱精子癥患者精子中不表達,提示其表達水平的缺失可能在弱精子癥中起重要作用。

2.3在男性生殖毒理中的研究生殖系統對金屬,尤其是鎘(Cd)、鉛(Pb)、汞(Hg)、鉻(Cr)、錳(Mn)等重金屬及其化合物的作用非常敏感,金屬對生殖系統的毒性存在劑量-效應關系,當毒性達到一定程度可能導致不育。將青春期鼠在不同劑量的Cd環境中暴露不同時間,然后觀察其精子的活力,利用cDNA微陣列分析睪丸基因表達情況,結果顯示當睪丸長期暴露于低劑量的Cd環境中,精子活力隨暴露時間延長和劑量增加而降低,鈣調節基因的轉錄和L型電壓依賴型鈣通道mRNA連接體的表達發生改變,而涉及調節精子活力的鈣連接蛋白并沒有受到影響[34]。Cheng等將TM4大鼠的Sertoli細胞放在1mmol/L的CrCl3中培養7d后提取mRNA[35],然后與芯片雜交,結果表明,Cr可能是通過對睪丸Sertoli細胞的調控而影響精子的發生。讓小鼠分別每日喂服1000mg/kg大黃素和50mg/kg丙烯酰胺,連用5d,然后應用cDNA微陣列和qPCR技術對2種藥物作用于睪丸后的基因表達差異進行比較分析,結果顯示2種藥物均可降低睪丸生精功能、改變嗜酸性粒細胞并使生殖細胞凋亡,對睪丸是有毒性作用[36]。

3總結

近年來,男性不育的發病率逐年上升,但是約30%~40%的生精功能異常病因不甚明了,此時基因改變可能是這些疾病的重要原因[37-39]?；蛐酒夹g的不斷完善和應用,能為男性不育病因診斷提供先進的研究手段。目前,基因芯片技術的研究存在一些難點,比如基因序列信息缺乏、探針的合成與固定比較復雜、實驗室操作標準化問題、費用過高和專利限制等,尚需要進一步研究。

作者：陳冠培趙永平金玲麗單位：浙江省寧海婦幼醫院北京大學人民醫院生殖醫學中心