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中國(guó)每年新發(fā)宮頸癌患者75000人，另有40000人死于宮頸癌［1］。研究表明，高危型人乳頭瘤病毒（humanpapillomavirus,HPV）持續(xù)感染是引起宮頸癌的主要致病因子［2-4］。高危型HPV主要包括16，18，31，33，35，39，45，51，52，56，58，59，66型［5-6］。通過定期進(jìn)行高危型HPV篩查，有助于預(yù)防和早期發(fā)現(xiàn)宮頸癌，減少宮頸癌的發(fā)病率和死亡率［7］。現(xiàn)有的2003年~2012年廣州地區(qū)的女性高危型HPV的感染情況的相關(guān)報(bào)道，由于研究對(duì)象和檢測(cè)方法的不同導(dǎo)致這十年的高危型感染狀況、型別分布情況存在很大的差異，即便同一年份的高危型HPV的感染情況也存在差異［8-13］。通過采用同種檢測(cè)方法對(duì)不同年份的高危型HPV感染情況進(jìn)行比較，有利于觀察廣州地區(qū)的女性高危型HPV的變化情況。為了更好地了解近兩年廣州市各年齡段女性高危型HPV的感染狀況、型別分布情況，以便對(duì)該地區(qū)宮頸癌的預(yù)防提供指導(dǎo)，本文對(duì)2013年和2014年來院就診的女性患者或體檢者宮頸分泌物中的13種高危型HPV特異性DNA核酸片段分型定性檢測(cè)結(jié)果進(jìn)行了回顧性分析。

1對(duì)象與方法

1.1對(duì)象2013年1月1日~2014年12月31日在廣州軍區(qū)廣州總醫(yī)院進(jìn)行宮頸分泌物高危型HPV分型檢測(cè)的門診、住院的女性患者及體檢者，共2501例，年齡18~82（41.14±9.091）歲。

1.2方法

1.2.1標(biāo)本采集女性生殖道用無菌生理鹽水棉球洗去宮頸外分泌物，再用無菌棉拭子插入宮頸內(nèi)，停5s后旋動(dòng)棉拭子采取宮頸分泌物，將棉拭子置入無菌試管內(nèi)，密閉送檢。

1.2.2試劑與儀器高危型HPV分型核酸測(cè)定試劑盒（熒光PCR法，上海之江生物科技股份有限公司），LightCycler®480實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀（羅氏公司）。

1.2.3高危型HPV分型檢測(cè)

1.2.3.1樣本及對(duì)照品反應(yīng)模板制備標(biāo)本試管中加入1mL無菌生理鹽水，充分振蕩混勻，吸液體至1.5mL離心管中，13000r/min離心5min。吸棄上清，加入1mL無菌生理鹽水，充分振蕩混勻，13000r/min離心5min。吸棄上清，沉淀加入100μL核酸提取液，振蕩混勻，金屬浴100℃10min。13000r/min離心5min，取上清4μL作為PCR反應(yīng)模板。陰陽性對(duì)照品各取100μL于1.5mL離心管中，分別加入核酸提取液100μL，充分混勻，金屬浴100℃10min。13000r/min離心5min，取上清4μL作為PCR反應(yīng)模板。

1.2.3.2試劑配制及加樣取8種配制好的PCR反應(yīng)液36μL于PCR反應(yīng)板中，加入4μL的樣本及對(duì)照品PCR反應(yīng)模板。

1.2.3.3PCR擴(kuò)增反應(yīng)板置于熒光定量PCR儀，循環(huán)參數(shù)94℃×10min；93℃×10s→62℃×31s，循環(huán)40次，單點(diǎn)熒光檢測(cè)在62℃，反應(yīng)體系40μL。熒光通道檢測(cè)選擇：選用FAM和VIC通道。

1.2.3.4質(zhì)量控制基線調(diào)整取6~15個(gè)循環(huán)的熒光信號(hào)，閾值設(shè)定原則以閾值線剛好超過陰性對(duì)照品檢測(cè)熒光曲線的最高點(diǎn)。陰性對(duì)照品檢測(cè)結(jié)果應(yīng)為：FAM、VIC通道Cq均無顯示，陽性對(duì)照品檢測(cè)結(jié)果應(yīng)為：Cq顯示≤35，否則無效。

1.2.3.5結(jié)果判斷當(dāng)8種檢測(cè)混合液FAM、VIC通道Cq均無顯示，檢測(cè)樣本判定為陰性；如Cq在38~40之間，需重復(fù)測(cè)定，如仍在38~40之間，且擴(kuò)增曲線呈典型的S型，則判斷為陽性，若非典型S型曲線，則判為陰性。按表1進(jìn)行結(jié)果判斷。1.2.4統(tǒng)計(jì)學(xué)分析采用SPSS16.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，各年份高危型HPV感染率、各年齡組高危型HPV感染率以及高危型HPV亞型構(gòu)成比都用行×列表資料的χ2檢驗(yàn)，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2結(jié)果

2.12013年和2014年高危型HPV陽性率2013年和2014年的體檢組、門診住院組和體檢組+門診住院組的高危型HPV的陽性率差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（表2）。

2.2各年齡組高危型HPV感染率2013年的983例女性宮頸分泌物標(biāo)本中，檢出高危型HPV146例。按年齡分為5個(gè)年齡組，<30歲組檢出10例，陽性率12.05%；30~歲組檢出48例，陽性率為14.33%；40~歲組檢出68例，陽性率為16.83%；50~歲組檢出15例，陽性率為11.63%；60歲以上組檢出5例，陽性率為15.63%。2014年的1518例女性宮頸分泌物標(biāo)本中，檢出高危型HPV221例。<30歲組檢出21例，陽性率15.33%；30~歲組檢出87例，陽性率為15.73%；40~歲組檢出77例，陽性率為13.34%；50~歲組檢出22例，陽性率為11.52%；60歲以上組檢出14例，陽性率為23.33%。2013年、2014年的各年齡組高危型HPV陽性率差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（表3）。

2.3高危型HPV亞型構(gòu)成比共檢出13種亞型，分別為16型，18型，31型，33型，35型，39型，45型，51型，52型，56型，58型，59型，68型。2013年的146例陽性標(biāo)本中，單一型別感染103例，二重感染39例，三重感染4例，檢出頻次為193，各亞型構(gòu)成比從高到低排列依次為HPV5218.13%，HPV1617.10%，HPV5815.54%，HPV568.29%，HPV397.77%，HPV516.73%，HPV685.70%，HPV595.18%，HPV314.15%，HPV354.15%，HPV183.11%，HPV332.59%，HPV451.55%。2014年的221例HPV陽性標(biāo)本中，單一型別感染183例，二重感染32例，三重感染6例，檢出頻次為265，各亞型構(gòu)成比從高到低排列依次為HPV5222.26%，HPV1616.23%，HPV5816.23%，HPV688.30%，HPV186.79%，HPV516.42%，HPV566.04%，HPV394.15%，HPV313.77%，HPV333.40%，HPV592.64%，HPV352.26%，HPV45，1.51%。2013年和2014年高危性HPV亞型的總體構(gòu)成比差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（表4）。

3討論

通過對(duì)2013年和2014年的女性宮頸分泌物標(biāo)本進(jìn)行13種高危型HPV亞型（16，18，31，33，35，39，45，51，52，56，58，59，68）檢測(cè)，結(jié)果顯示這兩年廣州地區(qū)女性高危型HPV總感染率分別為14.85%和14.56%，表明廣州地區(qū)女性高危型HPV感染率仍比較高，但兩年的感染率在體檢組、門診住院組和體檢+門診住院組間均無變化。Jing等［14］報(bào)道廣東地區(qū)HPV感染率為7.3%，林盈等［15］報(bào)道深圳龍崗地區(qū)高危型HPV感染率為15.9%，黃玉芳等［16］報(bào)道廈門地區(qū)高危型HPV感染率為16.01%，錢慧珍等［17］報(bào)道大連地區(qū)高危型HPV感染率為13.73%。可能由于研究的地區(qū)、人群、檢測(cè)的亞型數(shù)量以及檢測(cè)方法不同，與其他地區(qū)已報(bào)道的高危型HPV感染率比較，我們的結(jié)果存在一定差異。另外，我院2014年的標(biāo)本量比2013年的標(biāo)本量多1/3，側(cè)面反映了本地區(qū)醫(yī)患雙方對(duì)宮頸癌預(yù)防和早期診斷的認(rèn)識(shí)和自覺進(jìn)行HPV篩查的意識(shí)明顯提高。

受檢者年齡主要分布于30~50歲，該年齡段的受檢者占受檢總?cè)藬?shù)的1/3以上，可見該年齡段的女性自我保健意識(shí)比較強(qiáng)。雖然30歲以下和50歲以上的患者數(shù)量較少，有可能導(dǎo)致感染率相對(duì)偏高。但從最終的數(shù)據(jù)分析結(jié)果看，2013年和2014年各年齡段女性高危型HPV感染率并無明顯差異，因此建議更多30歲以下和50歲以上的女性也應(yīng)自覺進(jìn)行高危型HPV篩查。2013年和2014的高危型HPV的感染以單一型別感染為主，分別占53.37%和69.06%。多重感染僅檢出二重感染和三重感染，未檢出四重感染以上的多重感染。目前，大多數(shù)女性在一生的某個(gè)階段感染過HPV。大部分的HPV感染是無任何癥狀并且在6~18月能夠被自身免疫系統(tǒng)清除。僅少數(shù)女性會(huì)持續(xù)感染HPV并經(jīng)過一段潛伏期后發(fā)展為宮頸上皮內(nèi)瘤變［18］。相對(duì)于單一型別感染，多重感染的女性者更易發(fā)展為宮頸上皮內(nèi)瘤變2級(jí)及高度鱗狀上皮內(nèi)病變［19-21］。Muñoz等［6］報(bào)道全球90%的女性宮頸癌患者中檢出的HPV亞型的排序依次為HPV16、HPV18、HPV45、HPV31、HPV33、HPV52、HPV58、HPV35。其中HPV16、HPV18、HPV45、HPV31占所有檢出HPV亞型的80%［22］。

Wu等［23］報(bào)道中國(guó)宮頸癌患者中最常見的型別是HPV16、HPV58、HPV33、HPV18、HPV6、HPV31。Jing等［14］報(bào)道廣東地區(qū)的最常見的型別依次為HPV16、HPV52、HPV58、HPV18、HPV45。Shen等［24］報(bào)道河南地區(qū)的最常見型別依次是HPV16、HPV52、HPV58、HPV33、HPV18、HPV6、HPV39。而我們的分析發(fā)現(xiàn)，2013年和2014年廣州地區(qū)人群高危型HPV最常見的3種型別依次為HPV52、HPV16、HPV58型，占所有檢出高危型HPV亞型的50%以上。這3個(gè)HPV型別雖也見于上述國(guó)內(nèi)外報(bào)道中，但檢出頻率排序與他們又有所差異。目前的HPV疫苗主要是針對(duì)HPV16、HPV18、HPV6、HPV11，大量的研究表明注射疫苗可降低HPV16、HPV18導(dǎo)致的宮頸部感染，從而降低宮頸癌及宮頸癌前病變的發(fā)病率［25-26］。但由于疫苗只針對(duì)HPV16、HPV18、HPV6、HPV11，對(duì)于其他型別的HPV引起的感染未能夠起到很好的預(yù)防作用。因此，結(jié)合本地區(qū)HPV亞型感染頻率，開發(fā)新的多價(jià)疫苗或通用疫苗才能夠更好的預(yù)防HPV感染，降低本地區(qū)宮頸癌的發(fā)病率。

綜上，本研究分析了廣州地區(qū)2013年和2014年女性高危型HPV的總感染率、各年齡段的感染率、各亞型的構(gòu)成比，為宮頸癌的預(yù)防和疫苗的開發(fā)提供一定的指導(dǎo)。但由于本研究的對(duì)象來于同一家醫(yī)院，僅能代表廣州部分人群的的HPV感染情況。在后續(xù)的研究中，要加大樣本數(shù)量，才能為廣州地區(qū)的HPV感染現(xiàn)狀提供更加可靠的理論依據(jù)。

作者：陳靜娜 陳麗丹 張衛(wèi)云 楊永泉 唐榮芝 孫朝暉 李林海 單位：廣州軍區(qū)廣州總醫(yī)院檢驗(yàn)科