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禽類MHC對(duì)細(xì)胞之間的相互作用進(jìn)行免疫調(diào)節(jié)，其結(jié)構(gòu)與疾病防控研究密切相關(guān)[1]。MHC是編碼與免疫應(yīng)答直接相關(guān)的一類細(xì)胞膜糖蛋白基因群，存在高度多態(tài)性，能適應(yīng)和抵抗大部分病原微生物[2]。病原體驅(qū)動(dòng)的選擇是有利于MHC雜合子，表明MHC基因型和與宿主的抗病性或免疫應(yīng)答水平密切相關(guān)。MHCⅠ類等位基因與諸多疾病有關(guān)，并且復(fù)雜性和多態(tài)性使個(gè)體間的免疫應(yīng)答有所不同[3]。目前主要研究雞和鴨的MHC，而鵝的MHC研究較少，鵝的MHCⅠ存在高度多態(tài)性[4]，MHCIIβ片段來(lái)自不同的MHCIIB基因座[5]，MHC基因間存在著復(fù)雜的功能及協(xié)同互作，為此本試驗(yàn)分析GPV感染雛鵝的MHC多態(tài)性變異，以期為進(jìn)一步研究鵝的易感性及抗病機(jī)理奠定基礎(chǔ)。

1材料與方法

1.1試驗(yàn)動(dòng)物隨機(jī)選取生長(zhǎng)一致、健康的3日齡雛鵝，由青島農(nóng)業(yè)大學(xué)萊陽(yáng)五龍鵝實(shí)驗(yàn)基地提供。

1.2試驗(yàn)方法

1.2.1雛鵝處理將種毒GPVYZ經(jīng)口腔接種6日齡的雛鵝，每只接種0.2mL，感染組雛鵝（YZ）。同時(shí)對(duì)照組雛鵝（CK）接種等量的生理鹽水，連續(xù)觀察發(fā)病癥狀，分別采集肝臟。

1.2.2制備細(xì)胞懸液參照文獻(xiàn)[6]的方法，收集鵝肝臟細(xì)胞膜。

1.2.3膜蛋白的提取參照文獻(xiàn)[7]的方法，用TritonX-100抽提膜蛋白，丙酮沉淀，PEG6000濃縮，冷凍真空干燥粗膜蛋白。

1.2.4MHC的分離純化PBS溶解粗蛋白樣品，上樣于經(jīng)同樣緩沖液平衡的SephadexG-200柱脫鹽，梯度（0～0.6mol/LNaCl，PBS0.02mol/L）洗脫，收集合并活性蛋白部分，再上樣于預(yù)先用pH值6.3100mmol/LPBS平衡的BioGelP-100凝膠柱純化，用PBS（pH值6.3，100mmol）洗脫，收集純化的MHC，冷凍真空干燥。

1.2.5蛋白質(zhì)含量檢測(cè)總蛋白含量，參照文獻(xiàn)[8]，以BSA為標(biāo)準(zhǔn)，紫外法檢測(cè)，總蛋白含量（mg/mL）=1.55×A280-0.76×A260，系數(shù)F1=1.115，系數(shù)F2=0.76；MHC的含量，參照鵝MHCⅠ/Ⅱ酶聯(lián)免疫分析試劑盒（上海滬鼎生物科技公司LOT10-45-618）進(jìn)行測(cè)定，λ=450nm。

1.2.6SDS-PAGE參照文獻(xiàn)[9]，分離膠10%，12.5%，濃縮膠2.5%，室溫下25mA恒流，電泳6～7h。標(biāo)準(zhǔn)蛋白：MBISM0431。

1.2.7凝膠染色用0.12%CBBR250，乙醇-乙酸（25%～8%）溶液染色，乙醇-乙酸（20%～7%）溶液脫色，透射光下成像記錄。

1.2.8數(shù)據(jù)分析用QuantityOne/BandScan5.0軟件掃描、標(biāo)記SDS-PAGE凝膠條帶。

2結(jié)果與分析

2.1MHC的分離純化從圖1可知，粗提MHC經(jīng)柱層析分離純化，得到4個(gè)洗脫吸收峰:CKp1，YZp1，CKp2，YZp2。

2.2MHC的含量與比活力由圖2可知，粗提MHC的CK組含量是YZ組的1.2倍，均有MHCⅠ、MHCⅡ，比活力變化不明顯。純化的MHC，CK組與YZ組的二個(gè)蛋白峰含量相差3.6～4倍，CKp2，YZp2與CKp1，YZp1相差1～2倍，YZ組明顯降低。P2與P1的MHCⅠ/Ⅱ比活力差達(dá)65～79倍，P2是MHCⅠ/Ⅱ。YZ組MHC的比活力是CK組的86%～52%。

2.3粗提MHC的SDS-PAGE由圖5顯示，在非還原條件下，初級(jí)MHC的CK0和YZ0，均出現(xiàn)11條相同蛋白帶譜，蛋白主帶區(qū)為30～90ku、35ku、20ku，而肝臟蛋白CK和YZ也類似的顯示出13、12條蛋白帶。在還原條件下，初級(jí)MHC的CK0和YZ0分別出現(xiàn)了9、10條蛋白帶，肝臟蛋白CK和YZ也分別顯示出13、9條蛋白帶。CK0與YZ0相比較，大于100ku的為1∶0，100～45ku的為4∶5，小于45ku的是4∶5，并且YZ0明顯缺失84ku、61ku蛋白帶，主帶峰灰度值也明顯低于CK0。

2.4純化MHC的SDS-PAGE由圖4顯示，純化MHCⅠ/Ⅱ的特征帶是30ku，33ku，40ku，42ku低分子量蛋白。與CKp2相比，YZp2明顯缺失45ku蛋白帶，新增加34ku蛋白帶；而YZp1明顯缺失42ku蛋白帶，新增38ku蛋白帶。

3討論

MHC是一類細(xì)胞表面的轉(zhuǎn)膜蛋白，通過結(jié)合和向T細(xì)胞抗原特異性受體呈遞抗原片段發(fā)揮功能，與免疫反應(yīng)和抗病性密切相關(guān)。本試驗(yàn)研究顯示，粗提MHC的比活力達(dá)到較平穩(wěn)水平，純化MHC蛋白峰2與蛋白峰1的MHCⅠ/Ⅱ比活力差異明顯（65～79倍），YZ組的分離和純化MHC含量與比活力明顯低于CK組。表明GPV感染對(duì)鵝肝臟MHC基因表達(dá)產(chǎn)生了一定抑制作用，影響著雛鵝的免疫反應(yīng)調(diào)控和生理調(diào)節(jié)功效，促使病毒感染雛鵝。

MHC基因是一組緊密連鎖高度多態(tài)性的染色體基因群，MHC類分子的重鏈/α與輕鏈/β以非共價(jià)鍵結(jié)合，在細(xì)胞膜外折疊產(chǎn)生功能域，決定著他們的多態(tài)性，尤其是MHC分子中肽結(jié)合區(qū)，是多態(tài)性最高的區(qū)段，與抗原肽之間的親和力密切關(guān)聯(lián)抗病性/易感性。鵝MHC類分子等位基因之間的變異主要集中于α區(qū)，存在14個(gè)氨基酸高置換位點(diǎn)。本試驗(yàn)研究顯示，粗分離MHC出現(xiàn)了11條基本的蛋白帶譜，蛋白主帶區(qū)為30～90ku、35ku、20ku，與MHC類蛋白分子相一致，YZ0明顯缺失84ku、61ku蛋白主帶。提示GPV感染使雛鵝肝臟MHC的構(gòu)成發(fā)生明顯的變化，影響著各組分間的相互協(xié)作及對(duì)外源病原微生物侵襲的抵御力，因此MHC的多態(tài)性和抗病作用是疾病研究中的最佳候選標(biāo)記基因。而純化的MHC是30ku，33ku，40ku，42ku的低分子量特征蛋白，與重鏈/α（44kD/33kD）和輕鏈/β（12kD/29kD）相一致。YZ組明顯缺失45ku蛋白峰p2和42ku蛋白峰p1特征帶，新增加34ku蛋白峰p2和38ku蛋白峰p1帶；提示GPV的感染影響著雛鵝肝臟MHC基因的表達(dá)，使MHC分子產(chǎn)生較大變異，45ku、34kuMHC是GPV感染的敏感蛋白，42ku、38ku蛋白帶也與GPV的感染密切相關(guān)，因此，MHC抗原在起受體作用時(shí),會(huì)與病原體結(jié)合,易為GPV感染，成為GPV的易感基因。

作者：朱新產(chǎn) 畢經(jīng)帥 楊麗金 單位：青島農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院 山東省高校植物生物技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室