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［摘要］

目的測定未經抗病毒治療的慢性乙型肝炎病毒(HBV)感染者CD8+T細胞中Toll樣受體2(TLR2)的水平，探索TLR2在慢性HBV感染者CD8+T細胞中的表達的情況。方法采用實時熒光定量PCR檢測40例樣本的血清HBV載量，分為高病毒載量組(HBVDNA＞1×104拷貝/mL)、低病毒載量組(HBVDNA＜1×104拷貝/mL)，19例志愿者作為健康對照組;分離外周血單個核細胞，流式細胞術檢測CD8+T淋巴細胞亞群中TLR2和CD38、HLA-DR、CD95、程序性死亡蛋白1(PD-1)的表達，并分析TLR2表達情況及與它們之間的相關性。結果低病毒載量組與高病毒載量組CD8+T細胞TLR2的表達較健康對照組高，低病毒載量組CD8+T細胞TLR2表達高于高病毒載量組;相關性分析結果顯示CD8+T細胞亞群中TLR2和CD38、HLA-DR、CD95、PD-1表達缺乏相關性。結論HBV感染者CD8+T淋巴細胞TLR2的表達增強。

［關鍵詞］

Toll樣受體2(TLR2);乙型肝炎病毒(HBV);CD8+T細胞;免疫活化;耗竭

人感染乙型肝炎病毒后，CD8+T細胞介導的免疫應答對肝臟炎癥的發生、發展起著重要的作用［1－2］。一方面CD8+T細胞的持續活化是引起自身免疫、最后導致肝細胞受損的主要原因;另一方面，在慢性炎癥發展過程中，CD8+T細胞凋亡增多、不能徹底清除病毒是HBV持續存在的重要機制［3－4］。因此，調控CD8+T細胞的活化與凋亡，對了解HBV感染者病情的發展及轉歸具有十分重要的意義。Toll樣受體2(Toll-likereceptor2，TLR2)為TLR家族成員，其主要通過識別脂蛋白、脂多肽等病原相關分子模式引發細胞內信號通路導致炎癥發生，在天然免疫防御中起重要作用，并最終激活獲得性免疫系統［5］。本課題組前期研究發現，在HBV感染過程中，HBV復制活躍的感染者外周血單個核細胞中TLR2的蛋白水平和mRNA水平表達明顯低于HBV復制不活躍的感染者和健康對照者［6］。但由于PBMC的組成比較復雜，包括單核細胞、自然殺傷(naturalkiller，NK)細胞、樹突狀細胞、B細胞、CD4+T細胞、CD8+T細胞等。因此，本研究首先檢測TLR2在慢性HBV感染者CD8+T細胞表面的表達情況。其次，TLR2作為共刺激受體可以表達在活化的T細胞表面［7］，說明TLR2與T細胞的活化和功能密切相關，因此我們同時還檢測了CD8+T細胞表面與活化相關的CD38、HLA-DR分子和與凋亡相關的死亡受體Fas(CD95)、程序性死亡蛋白1的表達水平。并通過比較TLR2與這些分子表達的相關性，進一步確定慢性HBV感染者CD8+T細胞表面TLR2的表達是否與CD8+T細胞的活化或凋亡相關。

1材料和方法

1．1材料

1．1．1研究對象依據2010年慢性乙型肝炎防治指南(2011年更新)［8］的乙型肝炎患者診斷標準，采集慢性乙型肝炎患者的外周靜脈抗凝血。所有血液樣本均來自廣西中醫藥大學第一附屬醫院臨床門診，包括HBV感染者40例，其中男25例，女15例，年齡12～68歲，平均年齡45歲，研究經醫院倫理學委員會批準，患者知情同意。所有感染者按照HBVDNA載量分為2組［9］:高病毒載量組，HBVDNA大于1×104拷貝/mL，共20例;其中男12例，女8例，年齡20～68歲，平均(45±15)歲，所有病例經臨床檢測血清乙型肝炎病毒表面抗原陽性、乙型肝炎病毒e抗原(hepatitisBviruseantigen，HBeAg)陽性、乙型肝炎病毒e抗體陰性，ALT持續或反復升高。低病毒載量組，HBVDNA陽性但病毒載量小于1×104拷貝/mL，共20例，其中男13例，女7例;年齡12～62歲，平均年齡43歲，所有病例經臨床檢測血清HBsAg陽性，HBeAg持續陰性，HBeAb陽性或陰性，ALT持續或反復異常，或肝組織學檢查有肝炎病變。本研究另設健康對照組，均來自健康體檢者，共19例，其中男8例，女11例;年齡21～62歲，平均年齡34歲，身體健康，無免疫病史及免疫治療史。三組間年齡、性別差異無統計學意義，具有可比性。

1．1．2本研究所用主要試劑和儀器人淋巴細胞分離液購自Solarbio公司、RPMI1640培養基購自Hyclone公司、別藻藍蛋白標記的抗人CD3抗體(CD3-APC)、藻紅蛋白標記的抗人CD8抗體(CD8-PE)、AlexaFlour488標記的抗人TLR2抗體(TLR2-AF488)購自BD公司、藻紅蛋白-花青素7標記的抗人CD95抗體(CD95-PE-Cy7)、APC標記的抗人PD-1抗體(PD-1-APC)、多甲藻黃素-葉綠素-花青素5．5標記的抗人CD38抗體(CD38-PerCP-Cy5．5)、AlexaFlour700標記的抗人HLA-DR抗體(HLA-DR-AF700)均購自Biolegend公司，其余化學試劑均為進口或國產分析純。LSRFortessa型流式細胞儀購自BD公司，1-14型離心機購自Sigma公司，ST16R型低溫超速離心機購自ThermoFisherScientific公司，ResearchPlus系列可調微量移液器購自Eppendorf公司，光學顯微鏡購自徠卡公司。

1．2方法

1．2．1PBMC懸液的制備采集受試對象外周肝素抗凝血液2mL，充分混勻，加入PBS，以1∶1比例將血液稀釋混勻，使用人淋巴細胞分離液，密度梯度離心法分離獲得PBMC，進行細胞計數，調整細胞數至1×104個/mL。

1．2．2流式細胞術檢測CD8+T淋巴細胞亞群中TLR2和CD38、HLA-DR、CD95、PD-1的表達取1．5mL離心管，加入100μLPBMC懸液;嚴格按照說明書將相應的熒光基團標記抗體:CD3-APC、CD8-PE、TLR2-AF488、HLA-DR-AF700、CD38-PerCP-Cy5．5、CD95-PE-Cy7、PD-1-APC，加入離心管底并充分混勻，4℃避光孵育30min;加入PBS液800μL洗細胞，共2次;加入1mL40g/L多聚甲醛溶液重懸細胞，2h后用流式細胞儀進行檢測。

1．2．3統計學分析采用Prism6．0統計軟件進行分析，所有數據結果以x±s表示。采用成組設計2樣本均數t檢驗統計方法比較不同病毒載量組與健康對照樣本CD8+T細胞TLR2表達差別，P＜0．05表示差異有統計學意義。同時分析CD38、HLA-DR、CD95、PD-1各指標間的相關性。

2結果

2．1HBV感染者CD8+T細胞群中TLR2表達增強，以低病毒載量組更明顯健康對照組、低病毒載量HBV感染者、高病毒載量HBV感染者CD8+T細胞群中TLR2表達量分別為0．653±0．332、4．635±2．874、2．185±1．074。與健康對照組相比，低病毒載量HBV感染者和高病毒載量HBV感染者的TLR2表達量升高，差異均具有統計學意義(P＜0．01);與高病毒載量組比較，低病毒載量組HBV感染者的TLR2表達升高，差異具有統計學意義(P＜0．01，圖1)。

2．2HBV感染者CD8+T細胞群TLR2與細胞活化與凋亡不相關HBV感染者CD8+T細胞TLR2表達與CD38、HLA-DR、CD95、PD-1的表達均無相關性(r=0．005、r=0．064、r=－0．172、r=－0．007，P＞0．05，圖2)。

3討論

CD8+T細胞是抗HBV免疫應答主要的效應細胞，病毒短暫感染、持續性感染、肝細胞損傷輕微或嚴重程度均與CD8+T淋巴細胞在體內的活化與耗竭情況相關［10－12］。CD8+T細胞主要通過接受抗原提呈細胞(antigenpresentingcell，APC)提呈抗原，在共刺激分子的作用下分化為效應性細胞或凋亡細胞，這個過程有很多分子參與，包括CD8+T細胞表面的活化分子CD38、HLA-DR和凋亡分子CD95(Fas)、PD-1等。TLR2是TLR家族中表達范圍最廣，識別病原微生物種類最多的成員［13］。表達在固有免疫細胞表面的TLR2主要通過識別病原體表面的配體，促進APC對病原體的吞噬，同時也通過誘導巨噬細胞、樹突狀細胞(dendriticcells，DC)活化，分泌多種細胞因子如腫瘤壞死因子α、白細胞介素1、IL-6、IL-8等發揮免疫作用，屬固有免疫范疇［14－15］。表達在適應性免疫細胞表面的TLR2，因識別的配體不同可正向或負向的調節T細胞的活性、功能和促進細胞因子產生等作用，并可作為共刺激受體延續和激活記憶性T細胞［16－19］。

本研究結果表明，無論高病毒載量還是低病毒載量的慢性HBV感染者CD8+T細胞表面TLR2表達與健康對照組比較均升高，并且低病毒載量組CD8+T細胞TLR2的表達明顯高于高病毒載量組TLR2的表達，提示TLR2可能參與CD8+T細胞抗HBV病毒及HBV感染慢性化的過程。為進一步驗證HBV感染者CD8+T細胞表面TLR2表達與CD8+T細胞活化與耗竭的相關性，本研究同時檢測了相應HBV感染者CD8+T細胞表面與活化和凋亡相關的免疫分子的表達水平。CD38分子和HLA-DR均是T細胞免疫活化的標志，在許多急性或慢性感染中，T細胞表面CD38和HLA-DR的表達均會升高［20－21］。而CD95主要介導T淋巴細胞的凋亡，PD-1是一種重要的免疫抑制分子，在外周血免疫耐受中發揮著重要的作用。慢性HBV感染過程中，這2個分子在T細胞表面表達均升高［22－25］。

本研究結果表明，這4個分子在慢性HBV感染者CD8+T細胞表面的表達亦升高(結果未顯示)，但與TLR2的表達是否有相關性呢?我們進行了相關性分析，結果表明，HBV感染過程中，CD8+T細胞TLR2的表達與CD38、HLA-DR、CD95、PD-1的表達不存在相關性，提示TLR2在HBV感染者CD8+T細胞上的表達與T細胞的活化及耗竭無關。但值得關注的是，HBV感染過程中，無論是高病毒載量組或低病毒載量組，CD8+T細胞TLR2均維持高水平表達，因此是否還存在著其他機制來說明CD8+T細胞TLR2表達的意義，還需進一步的實驗研究來證實。

作者：運晨霞 肖健 康迪 王啟輝 彭麗姍 劉顯 冷靜 單位：廣西特色實驗動物病證模型重點實驗室 廣西中醫藥大學醫學免疫學與微生物學教研室 鄭州市兒童醫院檢驗科 廣西醫科大學免疫學教研室