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摘要：2017年8月四川省某規(guī)?；i場(chǎng)出現(xiàn)臨產(chǎn)母豬產(chǎn)弱子、發(fā)抖、死胎，且死胎率達(dá)30％，哺乳仔豬成活率明顯降低，其中以全身性或局部性陣發(fā)痙攣為典型癥狀。用RT－PCR擴(kuò)增及序列分析確診該豬場(chǎng)感染了一種新型的豬非典型瘟病毒（APPV）。這是四川省首次檢測(cè)到并報(bào)道APPV，可為該病的研究和防控提供了一定的參考。

關(guān)鍵詞：陣發(fā)痙攣；豬非典型瘟病毒；診斷

豬非典型瘟病毒（Atypicalporcinepestivirus，APPV）是近年來(lái)新發(fā)現(xiàn)的一種新型瘟病毒［1］，與豬瘟病毒（Classicalswinefevervirus，CSFV）、牛病毒性腹瀉病毒（Bovineviraldiarrheavirus，BVDV）、邊界病毒（Borderdiseasevirus，BDV）等同屬瘟病毒屬（Pestivirus）黃病毒科（Flaviviridae）［2］。豬群感染該病毒后可引起新生仔豬的先天性震顫癥A－Ⅱ型（CT；myocloniacongenita），俗稱“仔豬抖動(dòng)病”，其特征是在出生后數(shù)小時(shí)內(nèi)可觀察到骨骼肌的雙側(cè)痙攣收縮，并造成無(wú)法吮乳的現(xiàn)象，嚴(yán)重時(shí)可損傷仔豬的腦和脊髓，給養(yǎng)豬業(yè)造成巨大的經(jīng)濟(jì)損失［3－4］。該病呈廣泛的地理分布，病毒檢出率也在日趨上升，自2015年在美國(guó)報(bào)道該病毒以來(lái)，又逐漸在德國(guó)、荷蘭、西班牙、奧地利和中國(guó)等地相繼被報(bào)道［1，5－9］。近年來(lái)，APPV已經(jīng)引起越來(lái)越多的學(xué)者的關(guān)注［1，5－9］。2017年，該病在國(guó)內(nèi)外的報(bào)道中被指出能夠造成規(guī)?；i場(chǎng)哺乳仔豬80％的發(fā)病率以及30％～60％的病死率［9－10］。經(jīng)遺傳進(jìn)化分析表明APPV復(fù)雜多樣，不同地區(qū)的分離株具有高度可變性［9］。本試驗(yàn)中對(duì)該豬場(chǎng)的患病豬及死亡豬進(jìn)行臨床診斷和實(shí)驗(yàn)室確診，最終確診為APPV感染。這也是首次證明了四川規(guī)模化豬場(chǎng)存在APPV感染。

1材料與方法

1．1材料

1．1．1病料來(lái)源采集四川省某規(guī)?；l(fā)病豬場(chǎng)的新鮮死胎、弱仔。

1．1．2主要試劑與儀器Trizol試劑盒（RNAisoPlus），上海英駿生物科技有限公司產(chǎn)品；DEPC、酚、SDS試劑，Sigma公司產(chǎn)品；三氯甲烷、無(wú)水乙醇、異丙醇等試劑，成都科龍化工公司產(chǎn)品；PKA酶，默克集團(tuán)產(chǎn)品；QuickTaqHSDyeMix，東洋紡生物科技有限公司產(chǎn)品；MarkerⅡ、PrimeScriptTMRT試劑盒，大連寶生物公司產(chǎn)品；PCR產(chǎn)物純化試劑盒，北京鴻躍創(chuàng)新有限公司產(chǎn)品；感受態(tài)細(xì)胞EscherichiacoliDH5α，北京天根生化科技有限公司產(chǎn)品；LB培養(yǎng)基，青島海博試劑有限公司產(chǎn)品；高速離心機(jī)5804，Eppendorf公司產(chǎn)品；普通PCR儀、核酸蛋白電泳儀、凝膠成像系統(tǒng)VersaDoc2000，Bio－Rad公司產(chǎn)品。1．1．3引物參照文獻(xiàn)［8，11］中瘟病毒（Panpesti－virus，PP）通用引物序列，豬瘟病毒（CSFV）、豬繁殖與呼吸綜合征（Porcinereproductiverespirato－rysyndrome，PRRSV）、豬圓環(huán)病毒2型（Porcinecircovirustype2，PCV－2）和豬偽狂犬病病毒（Pseu－dorabiesvirus，PRV）的特異性檢測(cè)引物，由生工生物工程（上海）股份有限公司合成（表1）。

1．2方法

1．2．1核酸的提取取心、脾、肺、腎、腦、淋巴結(jié)等組織器官并將其剪碎，同時(shí)取適量全血，所有樣本都一式兩份，分別根據(jù)RNA和DNA的提取方法進(jìn)行操作。提取的DNA和RNA置于－80℃保存?zhèn)溆?。利用PrimeScriptTMRT試劑盒將RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA并置于－20℃待用。

1．2．2PCR檢測(cè)對(duì)提取的DNA和反轉(zhuǎn)錄后的cDNA模板，進(jìn)行PCR擴(kuò)增反應(yīng)。取擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)20g／L的瓊脂糖凝膠核酸電泳和凝膠成像掃描儀進(jìn)行檢測(cè)。

1．2．3PCR產(chǎn)物的純化、克隆以及轉(zhuǎn)化對(duì)檢測(cè)呈陽(yáng)性的PCR產(chǎn)物按照PCR純化試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行操作純化目的條帶，并按照pMD19－T載體說(shuō)明書進(jìn)行加樣，酶連體系如下：4．5μL回收產(chǎn)物，0．5μLpMD－19Tvector，5μLSolutionI，16℃，連接10h～12h。將上述的連接產(chǎn)物按照感受態(tài)細(xì)胞E．coliDH5α操作說(shuō)明書進(jìn)行轉(zhuǎn)化，將菌液涂布在加了氨芐青霉素的LB平板上，37℃過(guò)夜培養(yǎng)。

1．2．4菌落PCR鑒定以及測(cè)序在37℃培養(yǎng)箱過(guò)夜培養(yǎng)的平板上隨機(jī)挑取單菌落置于10μL的無(wú)菌水中，并取2μL作為模板做菌落PCR鑒定，將鑒定為陽(yáng)性的菌液加入含氨芐青霉素的LB液體培養(yǎng)基中，搖菌10～12h后送至生工生物工程（上海）股份有限公司測(cè)序。

1．2．5相似性及進(jìn)化樹分析將測(cè)序結(jié)果在NCBI上進(jìn)行BLAST比對(duì)后，使用Megalign6．0軟件進(jìn)行相似性比對(duì)以及MEGA7的鄰近法（Neighbor－joining）構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹，并通過(guò)自舉分析（Boot－strap）作置信度檢測(cè)，自舉數(shù)據(jù)集為1000次。

2結(jié)果

2．1發(fā)病情況、臨床癥狀和病理剖檢

2017年3月以來(lái)，四川某規(guī)?；i場(chǎng)，母豬陸續(xù)出現(xiàn)產(chǎn)死胎、木乃伊胎，死胎、木乃伊率達(dá)16％。隨后發(fā)現(xiàn)部分母豬整窩出現(xiàn)初生仔豬全身不自主地抖動(dòng)，頭部搖擺，后肢無(wú)力，不能站立，行動(dòng)遲緩，無(wú)法進(jìn)行吸吮乳汁，但未見癱瘓癥狀，部分豬只逐漸出現(xiàn)死亡，個(gè)別豬只在2周～3周后可康復(fù)但同時(shí)也表現(xiàn)為預(yù)后不良。母豬發(fā)病率約為20％，不同窩內(nèi)發(fā)病率為20％～100％，發(fā)病母豬各種胎齡均有發(fā)生。對(duì)消瘦的病死仔豬進(jìn)行解剖，發(fā)現(xiàn)其腦血管周圍、腦部、肺臟有出血，脾臟局部壞死灶和邊緣梗死的情況（圖1）；其他組織器官無(wú)明顯病理變化。

2．2PCR檢測(cè)

提取所采集的心、脾、肺、腎、腦、淋巴結(jié)等組織和全血的DNA和RNA，用PCR方法對(duì)CSFV、PRRSV、PCV－2和PRV等病原進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果均為陰性；再使用瘟病毒屬通用引物對(duì)以上cDNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增，并對(duì)PCR產(chǎn)物進(jìn)行電泳檢測(cè)，擴(kuò)增片段約為800bp，與預(yù)期的818bp相一致（圖2）。

2．3序列分析

將克隆轉(zhuǎn)化后測(cè)序得到的序列在NCBI上進(jìn)行BLAST序列比對(duì)，結(jié)果顯示是APPV毒株（Atypicalporcinepestivirus）。用Magalign6．0分子生物學(xué)軟件將測(cè)序得到的基因序列和GenBank上已經(jīng)發(fā)表的參考序列進(jìn)行序列同源性比對(duì)。結(jié)果顯示該病毒的核苷酸序列與其他APPV參考株的核苷酸及氨基酸同源性分別為84．8％～92．1％和95．9％～98．1％，與其同源性最高的是德國(guó)株LT594521．1。

2．4系統(tǒng)進(jìn)化樹分析

為了進(jìn)一步確定該病毒與國(guó)內(nèi)外已發(fā)表的參考毒株之間的遺傳進(jìn)化關(guān)系，運(yùn)用MEGA7生物學(xué)軟件的鄰近法構(gòu)建其系統(tǒng)進(jìn)化樹狀圖，結(jié)果如圖3所示。從核苷酸系統(tǒng)進(jìn)化樹中可以看出，瘟病毒目前可分為兩大分支，APPV為一大分支，其他瘟病毒為另外一大支，該病毒與CSFV、BVDV、BDV同屬瘟病毒屬，但與APPV親緣關(guān)系較近且單獨(dú)聚為一支。本研究鑒定的APPV與德國(guó)毒株KU041639．1、澳大利亞毒株KX778724．1以及中國(guó)毒株（KY624591．1、KX950762．1、KX950761．1、KY612413．1）的序列親緣關(guān)系較近，但單獨(dú)聚為一支，說(shuō)明本研究鑒定的APPV可能是一株新的毒株。

3討論

在過(guò)去的十幾年中，越來(lái)越多的新型瘟病毒已在國(guó)內(nèi)外被發(fā)現(xiàn)［4－10］，在美國(guó)，德國(guó)，荷蘭和奧地利等許多國(guó)家已被鑒定。2013年，在澳大利亞的數(shù)個(gè)豬場(chǎng)的新生仔豬群中暴發(fā)了重復(fù)性肌陣攣（“顫動(dòng)仔豬”）［12－18］，大量仔豬可見營(yíng)養(yǎng)失調(diào)，尤其是這種震顫綜合征的并發(fā)癥。由于此病暴發(fā)，仔豬總體死亡率增加，且每頭母豬的斷奶仔豬數(shù)降低了超過(guò)10％。2015年，通過(guò)宏基因組測(cè)序首次在美國(guó)的豬群中發(fā)現(xiàn)并確定一種與CT型A－Ⅱ相關(guān)的新型瘟病毒［2，16］。該病毒可以在患病仔豬的不同組織、體液和中樞神經(jīng)系統(tǒng)中檢測(cè)到，并且在APPV呈陽(yáng)性的母豬和先天性震顫感染的仔豬的血清中檢測(cè)到AP－PV特定抗體，同時(shí)對(duì)感染仔豬的中樞神經(jīng)系統(tǒng)進(jìn)行組織學(xué)檢查發(fā)現(xiàn)小腦和脊髓的白質(zhì)出現(xiàn)中度的髓鞘形成減少［9］。在本試驗(yàn)中，通過(guò)RT－PCR方法在哺乳仔豬中檢測(cè)到APPV，這是四川省首次檢測(cè)到并報(bào)道該病毒。本研究中患病豬的臨床癥狀為APPV典型癥狀全身性或局部性陣發(fā)痙攣。首先利用PCR方法排除了CSFV、PRRSV、PCV－2和PRV等病毒的感染。運(yùn)用瘟病毒通用引物對(duì)樣本進(jìn)行RT－PCR擴(kuò)增，電泳結(jié)果顯示擴(kuò)增片段與預(yù)期目的條帶818bp相近，經(jīng)過(guò)序列分析比對(duì)，說(shuō)明該毒株是一株AP－PV。通過(guò)克隆測(cè)序，本研究鑒定的病毒與其他AP－PV參考株的核苷酸及氨基酸同源性分別為84．8％～92．1％和95．9％～98．1％；從目前的研究來(lái)看，與中國(guó)廣州毒株P(guān)PV1（KY652092）和GD2（KX950762）同源性相對(duì)較低，分別為91．4％和84．8％。系統(tǒng)進(jìn)化樹構(gòu)建和同源性分析表明，中國(guó)發(fā)現(xiàn)的APPV毒株存在地域差異性。遺傳進(jìn)化結(jié)果表明本研究鑒定的APPV可能是一種新的毒株。本研究首次在四川地區(qū)規(guī)?；i場(chǎng)確定APPV的感染，且有與國(guó)內(nèi)APPV毒株具有明顯的遺傳差異，我們將進(jìn)一步對(duì)該病毒的分子特征和致病機(jī)制進(jìn)行探究。由于該病目前也沒有預(yù)防用生物制品，建議該豬場(chǎng)應(yīng)加強(qiáng)豬場(chǎng)管理，嚴(yán)格執(zhí)行檢疫制度，堅(jiān)持自繁自養(yǎng)，減少健康豬同病豬之間直接或間接的接觸。嚴(yán)禁從有疫病的國(guó)家和地區(qū)引進(jìn)種豬、豬精液與胚胎和血液制品，從非疫區(qū)引進(jìn)的種豬要嚴(yán)格檢疫。引進(jìn)種豬到豬場(chǎng)后應(yīng)嚴(yán)格隔離觀察8周以上。同時(shí)加強(qiáng)豬舍消毒，實(shí)行全進(jìn)全出制度。使用優(yōu)質(zhì)疫苗對(duì)豬群進(jìn)行免疫，提高防疫效果。

作者：周可磊 陳新諾 岳華 張斌 單位：西南民族大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院