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禽白血病是由禽白血病病毒(Avianleukosisvirus，ALV)引起的禽類多種腫瘤性疾病的統稱。ALV屬于反轉錄病毒科，禽C型反轉錄病毒屬。根據病毒感染的宿主范圍、干擾譜和囊膜抗原，可以將ALV進一步區分為A至G7個亞群。J亞群ALV(ALV-J)最早于1988年在英國分離得到[2]。1999年中國首次報道ALV-J的出現，繼而中國大部分地區相繼出現ALV感染的報道[3-5]。ALV大范圍的流行給我國養禽業造成了嚴重的經濟損失[6]。目前，該病的主要預防方法為淘汰陽性雞，選育出無白血病雞群以凈化種群[7]。因此，該病的準確診斷尤為重要。本實驗利用原核表達的重組衣殼蛋白(p27蛋白)免疫小鼠，通過雜交瘤技術最終獲得一株抗p27蛋白的單克隆抗體(MAb)。并通過對p27蛋白的截短表達，確定了該MAb識別的抗原表位，為禽白血病病原檢測方法的建立提供了有利的工具。

1材料和方法

1.1病毒株、細胞和實驗動物ALV-JHPRS103株、ALV-ARAV-1株和ALV-BRAV-2株均由英國Pirbright研究所DrNair惠贈；DF-1、S/P20細胞由本實驗室保存；6周齡BALB/c雌鼠由本研究所實驗動物中心提供。

1.2主要試劑大腸桿菌(E.coli)DH5α和BL21感受態購自天根生化科技(北京)有限公司；pET-30a質粒由本實驗室保存；PEG-4000、HPR標記的羊抗鼠IgG(IgG-HRP)、羊抗鼠IgG-FITC購自Sigma公司；抗體亞類鑒定試劑盒購自賽默飛公司；蛋白純化用材料購自GEhealthcare。

1.3重組表達質粒的構建及目的蛋白的表達根據ALV-JHPRS103株的序列(Z46390)設計一對引物5'-CACGAATTCAGCGCCTGCTACGGTGGTGACCC-3'(EcoRⅠ)/5'-ACTCTCGAGGGAGTTCATCTATTGCAACAACCAG-3'(XhoⅠ)。經PCR擴增p27目的基因，通過EcoRⅠ/XhoⅠ雙酶切后克隆于pET-30a中，構建重組表達質粒pET-p27。將其轉化BL21E.coli感受態細胞中，經IPTG誘導表達，制備p27重組蛋白，按照文獻[8]方法對重組蛋白進行純化。

1.4動物免疫及細胞融合將純化的p27蛋白與等體積的弗氏完全佐劑乳化，對小鼠(100μg/只)進行頸背部皮下注射。兩周后，以弗氏不完全佐劑乳化的p27蛋白對小鼠進行加強免疫。間隔兩周，用二免同樣的方法進行第3次免疫。三免后21d，用純化的p27蛋白(100μg/只)對小鼠進行腹腔注射，3d后，取小鼠脾細胞與SP2/0骨髓瘤細胞進行融合[9]。

1.5雜交瘤細胞的篩選及MAb的亞類鑒定以純化的p27蛋白作為檢測抗原，通過間接ELISA方法進行雜交瘤細胞株的篩選。將篩選到的陽性雜交瘤細胞株利用有限稀釋法進行克隆純化3代，直到陽性率為100%。將純化的雜交瘤細胞按文獻[11]的方法腹腔接種6周齡～8周齡的小鼠制備小鼠腹水MAb。并利用MAb亞型試劑盒對其進行亞類鑒定。具體步驟參考說明書。

1.6MAb的間接免疫熒光(IFA)鑒定將ALV-A、ALV-B和ALV-J分別接種于DF-1細胞單層中，連續培養4d后，將細胞單層經無水乙醇固定15min，以制備的MAb(1∶100)為一抗，羊抗鼠IgG-FITC(1∶100)為二抗，通過顯微鏡觀察進行IFA鑒定。

1.7抗原表位的初步鑒定將p27編碼基因分成部分重疊的6段：p27-1(aa1-aa111)、p27-2(aa91-aa177)、p27-3(aa151-aa239)、p27-4(aa91-aa125)、p27-5(aa119-aa153)和p27-6(aa147-aa177)，PCR擴增后，克隆于原核表達載體pGEX-6P-1中，陽性重組質粒測序正確后轉化E.coliBL21，并以IPTG誘導進行重組蛋白的表達。以制備的MAb作為一抗，羊抗鼠IgG-HRP作為二抗對表達的多肽進行westernblot鑒定，初步確定p27抗原表位所在的區域。將MAb識別的p27片段繼續進行截短表達，并采用原核表達的肽段包被96孔ELISA反應板，以制備的MAb作為一抗，羊抗鼠IgG-HRP作為二抗檢測所表達肽段與MAb的反應情況，從而確定p27抗原表位所在的位置。

2結果

2.1p27蛋白的原核表達、純化及鑒定以ALV-JHPRS103cDNA為模板，通過PCR擴增p27目的基因，并通過雙酶切后克隆于pET-30a質粒中構建重組表達質粒pET-p27。將pET-p27轉化E.coliBL21后，經IPTG誘導獲得可溶性表達的重組p27蛋白。重組蛋白經過純化后，SDS-PAGE檢測結果顯示其分子量為36ku，與預期結果相符。

2.2陽性雜交瘤細胞株的建立、MAb效價測定及MAb免疫球蛋白亞類鑒定以原核表達的重組p27蛋白為免疫原免疫小鼠后，將小鼠脾細胞與SP2/0骨髓瘤細胞融合，通過間接ELISA篩選陽性克隆以及3次雜交瘤細胞克隆純化，最終獲得一株持續分泌ALVp27蛋白的雜交瘤細胞株，命名為2C7。采用已建立的間接ELISA方法對2C7進行MAb效價測定，結果顯示小鼠腹水的效價為212。其IgG亞型為IgG1/Kappa。

2.3MAb的特異性鑒定將純化的重組蛋白進行westernblot鑒定。結果顯示，在36ku處出現特異性條帶，而空載體對照未出現相應條帶。表明MAb2C7能夠識別ALV的衣殼蛋白p27(圖2A)。將ALV-A、ALV-B和ALV-J分別接種于DF-1細胞，未接毒的DF-1細胞作為陰性對照。接毒后4d以MAb2C7作為一抗，進行IFA試驗。IFA試驗結果表明，制備的MAb2C7與ALV-A，ALV-B和ALV-J均呈陽性反應(圖2B)，表明該MAb能夠與不同亞群的ALV反應。

2.4MAb線性抗原表位的鑒定將p27編碼基因分成部分重疊的6段：p27-1(aa1-aa111)、p27-2(aa91-aa177)、p27-3(aa151-aa239)、p27-4(aa91-aa125)、p27-5(aa119-aa153)和p27-6(aa147-aa177)分別克隆于pGEX-6P-1中進行原核表達。以MAb2C7為一抗，對表達的重組蛋白進行westernblot驗證。結果顯示，重組蛋白p27-5能夠與MAb2C7發生特異性反應(圖3)。表明p27蛋白的抗原表位可以初步確定在aa119～aa153之間。將p27-5進一步進行截短表達p27-7(aa119-aa134)、p27-8(aa129-aa142)和p27-9(aa137-aa153)，利用表達的肽段包被96孔ELISA檢測板，以MAb2C7作為一抗，羊抗鼠IgG-HRP作為二抗進行檢測。結果表明多肽p27-8能夠與MAb2C7發生特異性反應(圖4)。結果表明p27蛋白的抗原表位可以進一步確定為129LVAITASALQAFRE142。氨基酸序列比對結果顯示，本研究鑒定的p27線性表位在ALV-A、ALV-B和ALV-J亞群之間高度保守。因此，該表位對于ALV群特異性抗原檢測試劑盒的研究具有重要意義。

3討論

p27蛋白是病毒衣殼蛋白，在外源性ALV-A、ALV-B和ALV-J各亞群間同源性高達90%，含量高，占病毒總蛋白成分的30%以上，是制備檢測抗體的首選抗原，對禽白血病的診斷具有重要意義。本研究將p27蛋白進行原核表達，原核表達系統操作簡單，蛋白表達量高并且成本低。采用純化的原核表達蛋白作為免疫原免疫6周齡BALB/c雌鼠，最終篩選得到一株MAb2C7。Westernblot鑒定表明MAb2C7能夠識別ALV衣殼蛋白p27。IFA試驗表明MAb2C7能夠與家禽中常見的ALV亞群：A、B和J亞群病毒發生特異性反應，這表明該MAb與不同亞群ALV具有良好的反應活性，為禽白血病病原學診斷方法的建立提供了有利的工具。P27蛋白作為ALV的群特異性抗原，因為其序列保守并且含有許多抗原性強表位而成為制備檢測抗體的首選抗原，對禽白血病的診斷具有重要意義。然而，目前對于p27蛋白抗原表位的分析很少。

確定蛋白上特異的抗原決定簇位點是研究蛋白質結構和功能的重要方法并且已經應用到疾病診斷和表位疫苗的研究中[11-13]。本研究通過對p27蛋白進行截短表達，確定了其抗原表位位于129LVAITASALQAFRE142。氨基酸序列比對結果顯示，本研究所鑒定的p27表位在ALV各亞群之間高度保守。因此，該表位對于ALV群特異性抗原檢測試劑盒的研究具有重要意義。本研究所制備的MAb2C7以及對p27抗原表位的分析為ALV感染的檢測、p27蛋白功能研究以及研發新的禽白血病ELISA抗原檢測試劑盒提供了有利的工具。

作者：李曉菲 朱海波 高奇 王琦 孫佳善 高玉龍 祁小樂 王永強 高宏雷 王笑梅 單位：中國農業科學院哈爾濱獸醫研究所 獸醫生物技術國家重點實驗室 禽免疫抑制病科技創新團隊 哈爾濱動物用生物制品國家工程研究中心有限公司 江蘇省動物重要疫病與人畜共患病協同創新中心