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白血病是造血系統的惡性腫瘤，其特征是骨髓、淋巴結等造血系統中一種或多種血細胞成分發生惡性增殖，并浸潤體內各臟器組織，導致正常造血組織細胞受抑制，產生各種癥狀。目前，對于此類疾病的治療主要采取傳統的化療手段，標準的化療方案僅能使40%~60%患者獲得暫時緩解，中位生存期一般不超過3a。大劑量化療聯合造血干細胞移植可使緩解率明顯提高，但除了極少數患者以外，其余大部分仍難免會復發，其顯著的不良反應使得患者的生活質量和治療信心受到嚴重影響。因此，尋找高效低毒的治療藥物，顯得尤為重要。我們以k562細胞作為研究對象，探討力達霉素（LDM）抗白血病的可能機制。

1材料

K562細胞（本室保存）；LDM（由中國醫學科學院醫藥生物技術研究所甄永蘇院士惠贈）；RPM-1640（美國Gibco公司）；胎牛血清（美國Biological公司）；MTT（噻唑藍）法檢測細胞增殖及細胞毒性試劑盒（南京凱基）；苔盼藍；兔抗人腫瘤壞死因子（TNF-α）抗體（美國Affinity公司）；Betaactin（β肌動蛋白）抗體（美國Affinity公司）

2方法

2.1細胞培養K562細胞株從液氮中復蘇后，用含10%胎牛血清的RPM-1640培養液在37℃，5%CO2恒溫培養箱中培養，所有實驗均采用對數生長期細胞。

2.2細胞增殖的檢測在96孔板加入細胞100μl/孔（約1×104），置37℃，5%CO2細胞培養箱中培養24h后，加入不同濃度力達霉素（LDM），再于恒溫培養箱孵育48h，加入50μlMTT，37℃孵育4h，使MTT還原為甲臜，1000g離心，吸出上清，每孔加入150μl二甲亞砜（DMSO）使甲臜溶解，平板搖床搖勻，于490nm波長處檢測每孔的吸光度（A）值，計算細胞成活率。

2.3細胞的計數離心收集K562細胞，制備單細胞懸液并作適當稀釋，細胞懸浮液與臺盼藍溶液以9∶1混合混勻，在3min內分別計數活細胞和死細胞，計算活細胞率。

2.4細胞凋亡形態的觀察將K562細胞2×105個/ml濃度接種于含10%的小牛血清的RPMI1640培養基中，置24孔板中，每孔2ml，加入不同濃度的LDM，設對照組，培養48h，轉入離心管，1000g離心，棄上清，取0.2ml涂片，冷風吹干，瑞氏染色10min，姬姆薩染液染10min，沖洗，晾干，在倒置顯微鏡下觀察。

2.5細胞培養上清中TNF-α表達的檢測將K562細胞置37℃，5%CO2細胞培養箱培養48h后1000×g離心，收集細胞培養上清。采用ELISA試劑盒進行檢測。

2.6凋亡相關蛋白的檢測離心收集K562細胞，預冷的PBS洗滌2次，加入裂解緩沖液1ml（PMSF10％）震蕩混勻，冰浴30min。細胞裂解物在4℃12000g離心5min，取上清。使用BCA（Bicinchoninicacid）蛋白定量試劑盒進行蛋白定量。等量的蛋白樣品進行SDS-PAGE，將電泳分離的蛋白轉移到PVDF膜（聚偏二氟乙烯膜）上。室溫下用含5%脫脂奶粉［PBS（磷酸緩沖鹽溶液）溶解］封閉1h。隨后加入一抗（1:500）4℃過夜。PBST（PBS溶液加上吐溫-20）洗膜3次，加入相應的二抗，37℃孵育1h，PBST洗膜3次。ECL曝光法顯色，通過成像系統捕獲圖像，并通過圖像分析系統對所得區帶進行掃描，比較各組的積分A值。

2.7統計學分析實驗數據采用SPSS17.0軟件進行單因素方差分析，實驗結果采用x±s表示。

3結果

3.1LDM對人白血病K562細胞增殖的影響不同濃度LDM素作用K562細胞48h后，置于全自動連續光譜酶標儀在490nm處測定A值。按公式：細胞存活率%=（加藥細胞A/對照A）×100，從而得出LDM對K562細胞作用的半數抑制濃度（IC50）為10-10mol/L。

3.2LDM對人白血病K562細胞活性的影響苔盼藍染色顯示，正常細胞無色，死細胞呈藍色。不同濃度LDM素作用于K562細胞48h后對其生長均有一定的影響。分別用10-12、10-11、10-10、10-9、10-8mol/L濃度的LDM素作用K562細胞。按公式：抑制率（IR）%=死細胞數（/活細胞數+死細胞數）×100，計算出IR值。測得IR值分別為（21.2±2.5）%、（37.5±0.97）%、（5.21±1.2）%、（64.5±1.6）%和（71.3±2.0）%。

3.3LDM對人白血病K562細胞凋亡形態的影響未經藥物處理的對照組K562細胞多呈圓形，經不同濃度LDM處理后，均出現明顯凋亡形態，包膜皺縮，有泡狀突起及不規則凹陷，胞核染色質濃縮，固縮，濃染，斷裂成小團塊分散在胞膜周邊，以至形成凋亡小體。

3.4LDM誘導人白血病K562細胞TNF-α在細胞培養上清中的表達結果顯示，10-8、10-10、10-12mol/L的LDM處理后，細胞培養血清中TNF-α的含量分別為16.2±4.0、35.0±2.9、51.0±3.6、60.5±0.5，對照組為（16.2±4.0）pg/ml，3個濃度組與對照組的差異均有統計學意義（P<0.01）。3.5LDM對人白血病K562細胞TNF-α表達的影響用10-8、10-10、10-12mol/L濃度LDM處理組48h后，TNF-α蛋白的表達量依次為0.42±0.01、1.67±0.13（P<0.01）和2.41±0.08（P<0.01），與對照組0.23±0.02相比，A值升高。4討論目前認為，腫瘤的發生和細胞增殖與細胞凋亡平衡失調有關。細胞凋亡是細胞內源性基因調控下的生理性細胞死亡方式，凋亡過程受阻是腫瘤發生的主要機制之一，同時也是臨床上腫瘤治療研究的熱點之一。

誘導凋亡是化療藥物抗白血病的重要機制。LDM（原名C-1027，lilamycin）是具有我國自主知識產權的烯二炔類（enediyne）抗生素，以其抗腫瘤的強烈活性及獨特的DNA切割方式而頗受重視。LDM由1個輔基蛋白和1個發色團組成，發色團是其活性部分。LDM能引起核苷酸堿基和序列特異性的DNA單鏈和雙鏈斷裂。大量研究表明，力達霉素具有較強的抗腫瘤活性，LDM能夠強烈抑制腫瘤生長和腫瘤轉移。最近有研究證明，LDM可以誘導腫瘤細胞染色體異常和端粒錯排。以往研究顯示，不同劑量LDM能誘導多種類型的腫瘤細胞死亡，如典型細胞凋亡，但其究竟確切作用于哪種凋亡通路目前尚不清楚。細胞凋亡是一種在基因控制下的細胞主動死亡過程，以核酸內切酶活化后將DNA分解為180bp整倍數的片斷DNA為特征。形態學上表現為細胞起泡，核固縮。LDM作用非常迅速，活性比一般抗腫瘤藥強。要抑制腫瘤細胞的生長，一方面可以通過影響細胞周期，使其不能進行正常的有絲分裂；另一方面可以促進細胞凋亡，以達到治療目的。本研究采用MTT法觀察了LDM對人白血病K562細胞增殖有抑制作用，其IC50值為10-10mol/L，作用均強于絲裂霉素和阿霉素，顯示出LDM對K562細胞有極強的殺傷作用。人白血病K562細胞經LDM處理后，細胞均出現明顯凋亡形態，胞膜皺縮，胞核固縮，濃染，斷裂成小團塊分散在胞膜周邊，以致形成凋亡小體。細胞凋亡是內外多因子復雜的相互作用誘導產生凋亡信號，目前普遍認為是一系列高度調控的半胱氨酸蛋白酶（caspase）在凋亡不同階段發揮作用，分為調控性caspase和效應性caspase形成凋亡信號轉導的酶級聯反應。TNF-α是一種具有廣泛生物學效應的細胞因子，因其可致腫瘤出血，并能抑制、殺傷體外培養的腫瘤細胞而得名。TNF-α的生物學活性占TNF總活性的70%～95%，其前體由223個氨基酸組成，相對分子質量為26，成熟的TNF-α含157個氨基酸，無蛋氨酸殘基，即無糖基化位點，TNF-α通過細胞膜上的受體（TNFR）發揮生物學活性。TNF的生物效應都是通過細胞表面的2種TNF受體（TNFR）引發，其信號轉導通路主要包括caspase家族介導的細胞凋亡、銜接蛋白TRAF介導的轉錄因子NF-B和JNK蛋白激酶的活化。

細胞凋亡的死亡受體途徑是指細胞凋亡由死亡受體［主要有Fas（factorassociatedsuicide）、TNFR（tumornecrosisfactorreceptor）家族和TGF-βR（transforminggrowthfactorβreceptor）等］介導，與各自的配體相互結合后激活下游的信號轉導。其中Fas和配體FasL（Fasligand）結合，通過死亡功能區活化接頭蛋白FADD（Fas-associatedproteinwithdeathdomain），而FADD又可以通過N端的死亡效應域DED（Deatheffectordomain）和Caspase-8相互作用引發細胞凋亡。本實驗研究證實，低濃度LDM可能通過上調TNF-α表達水平誘導K562細胞凋亡抑制其增殖，其作用機制有待進一步深入研究。

作者：穆丹 張志斌 章廣玲 劉志勇 陳靜 單位：河北聯合大學 生命科學學院 基礎醫學院 河北聯合大學附屬醫院