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作者：張葉蔣旭超錢海馬靜陸榮柱單位：江蘇大學基礎醫學與醫學技術學院預防醫學系

內質網是在細胞中由膜圍成的亞細胞器，是一個連續的膜囊和膜管網。真核細胞的內質網對大約1/3的新合成蛋白質進行修飾、折疊和寡聚化，從而使之形成正確的構象，參與脂質代謝和類固醇激素的合成以及鈣的儲存，因而內質網穩態的改變必將影響細胞功能，但細胞機體也擁有一條適應性通路即內質網應激(endoplasmicreticulumstress，ERS)來應對內質網功能紊亂[1]。內質網應激可以由多種干擾內質網功能的病理生理改變以及其他環境因素變化引起，如內質網腔內未折疊蛋白、錯誤折疊蛋白或多余蛋白過多、脂類或糖脂代謝失衡、內質網腔的氧化還原以及鈣離子等離子條件的改變，而各種化學污染物也已成為重要的誘發內質網應激的外界環境因素。在自然界，金屬與兩性金屬的比重大約占80%。其中，一些金屬（如砷、汞、鉛、砣）只要在體內蓄積就會產生潛在的毒性；另一些金屬通過與氧、硫化物或氯化物形成化合物而具有毒性[2]。目前，金屬污染嚴重是我國面臨的主要環境問題。另外，在日常生活和職業活動中，人們也不可避免地接觸一定量的金屬，但由于金屬引起的毒性機制尚不十分清楚，目前尚缺乏有效的防治方法。因而探討內質網應激與金屬毒性的關系有助于探討金屬毒性機制，促進金屬毒理學的發展。本研究將以幾種常見的金屬（如鉛、鎘、汞及甲基汞、鋁、鐵、錳、鉻、鎳、鈾）作一綜述，為揭示常見金屬神經毒性下內質網應激的發生特點和開發相應的化學保護劑提供參考資料。

1內質網應激及其相關的細胞應答信號通路

ERS是指細胞內質網鈣穩態失調或蛋白質加工運輸障礙，引起生理功能紊亂所致的一種亞細胞器應激反應過程。ERS可引起三種細胞應激效應：未折疊蛋白反應（UPR），內質網超負荷反應和固醇調節級聯反應。內質網應激通過激活這三條通路產生下游的五類內質網應激效應：（1）誘導內質網葡萄糖調節蛋白78及94（GRP78及GRP94）等分子伴侶蛋白的表達，促進錯疊與未折疊蛋白恢復正常構象、維持內質網和胞質Ca2+平衡；（2）抑制蛋白質翻譯，減輕內質網新生蛋白加工的負擔；（3）激活NF-κB的效應，可能促進抗炎反應；（4）影響脂類代謝，進而可能影響生物膜合成；（5）持續過強的內質網應激誘導細胞凋亡，內質網既含有促進凋亡的因子如半胱氨酸蛋白水解酶-12（Caspase-12）、生長停滯和DNA損傷誘導基因-153（CHOP/GADD153）等，也含有抑制因子如Bax蛋白抑制劑-1(BaxinhibitorI)、葡萄糖調節蛋白78（GRP78）、蛋白質二硫鍵異構酶（PDI）等。當內質網應激過強時，促凋亡機制占主導，能夠獨立地誘導細胞凋亡，其中，Caspase-12是內質網應激致凋亡的特異性標志[3，4]。在三種ERS反應中，UPR最為常見，研究也最為深入。UPR通過激活其下游三條信號通路來應對相應的應激（圖1）。UPR的三條信號通路分別由三種類型的ER駐留蛋白起始：1型ER跨膜蛋白激酶(IRE1)、雙鏈RNA依賴的蛋白激酶樣ER激酶(PERK)和活化轉錄因子6(ATF6)。IRE1信號通路：當內質網應激發生時，IRE1蛋白與GRP78分離，IRE1激酶結構域的反式自磷酸化活化自身的內切核酸酶活力，然后內切核酸酶精確切割其唯一底物———酵母中人工染色體(mRNAHAC1)或多細胞動物中x-box連接蛋白1(XBP1)；剪接后，有活性的部分轉位入胞核，幫助伴侶蛋白的轉錄。通過這一通路不僅編碼ER蛋白，折疊和修飾相關的酶，促進磷脂的合成，還包括編碼與膜泡運輸有關的蛋白，從而有利于非折疊蛋白的正確折疊。PERK信號通路：PERK與GRP78分離后，PERK激酶磷酸化真核轉錄起始因子-2的α-亞基(eIF2α)，從而阻斷蛋白合成，降低了去往ER的蛋白量，最終減輕了ER進行蛋白加工的負擔。磷酸化的eIF2可以優先起始特定mRNA的翻譯（如ATF4mRNA）。

而這種mRNA基因上的特殊結構起著重要的協調作用。ATF6信號通路：ATF6與GRP78分離后，ATF6包被在膜泡中從ER轉移到高爾基體中，并在高爾基體內先后被S1P和S2P蛋白酶水解，釋放胞質脫氧核糖核酸結合區即ATF6f，然后ATF6f轉位入核，激活基因表達。ATF6引起內質網應激元件基因啟動子區域激活，轉錄出的蛋白包括伴侶蛋白GRP78和GRP94、蛋白二硫異構酶(proteindisulphideisomerase，PDI)、轉錄因子CHOP和Xbox-bindingprotein1（XBP1），從而有利于內質網內非折疊蛋白恢復正確構象。

2內質網應激與幾種常見人體非必需金屬毒性的關系

2.1鉛

2.1.1神經細胞在大鼠神經膠質瘤細胞（C6細胞）中，鉛暴露可上調GRP78的mRNA和蛋白水平的表達，這可能和GRP78與鉛可緊密結合，將鉛隔離于非毒性位點有關；這也可能是內質網應激對鉛毒性的保護機制[6，7]。有研究發現，當以0.1和1μmol/L的鉛處理C6細胞7d后，其GRP78mRNA水平上調到對照組的2.5～3倍；而當以10μmol/L的鉛處理C6細胞7d后，Grp78mRNA水平下調，與對照組相比減少40%，這可能與高濃度鉛抑制內質網應激相關；同時發現，經鉛處理的GRP78蛋白水平具有劑量和時間效應[7]。張瑩等[8]的研究結果顯示，鉛可以使C6細胞的Grp78蛋白表達增加；在0.2μmol/L鉛染毒組中，染毒7和30d的GRP78蛋白表達顯著增高，其余各個時間點均無顯著性變化；但在1.0μmol/L鉛染毒組中，染毒1d后GRP78蛋白表達量開始顯著增高，鉛染毒30d時已達到鉛染毒前的6.3倍；在2.0μmol/L鉛染毒組中，0.5h開始GRP78蛋白表達量即顯著增高，鉛染毒7d時達到高峰，是鉛染毒前的4.3倍，到30d時表達量又下降為鉛染毒前的2.6倍。這可能是由于高表達的GRP78蛋白能與鉛結合，將鉛大量蓄積于神經膠質細胞中，從而可能對更為敏感的神經元和其他細胞提供保護；但在2.0μmol/L鉛染毒30d時，GRP78蛋白表達量下降，說明在鉛達到一定濃度且在膠質細胞中蓄積到一定量后，細胞的整體功能受損，蛋白質表達下降[8]。Qian等[9]采用Northern印跡方法分析1μmol/L鉛處理原代培養兩周的大鼠星形膠質細胞1周后的GRP78基因表達，發現處理組的GRP78基因表達與對照組相比明顯上調。

2.1.2血管內皮細胞鉛（2～25μmol/L）處理血管內皮細胞24h后，發現GRP78和GRP94在基因和蛋白水平上的表達上調，并具有劑量-效應關系；同時發現，經10μmol/L鉛處理后，GRP78和GRP94蛋白的表達上調，并具有時間-效應關系；同時，該研究進一步發現，鉛可通過c-Jun氨基端激酶-活化蛋白-1（JNK-AP-1）通路引起血管內皮細胞中GRP78和GRP94蛋白的上調，這些內質網應激特異蛋白表達的上調提示了內質網應激的發生[10]。

2.1.3NRK-52E細胞Stacchiotti等[11]以腎小管細胞株NRK-52E為模型研究了鉛誘導的腎中毒，發現60和300μmol/L的氯化鉛不能上調Hsp72蛋白的表達，但能誘導GRP78蛋白的表達上調，從而提示鉛可選擇性誘導內質網應激的發生。在重組體肝癌細胞HepG2中，鉛暴露也可誘導GRP78和GADD153基因啟動子的上調，且具有劑量效應；在硝酸鉛濃度為100μmol/L時，GRP78基因啟動子上調到空白對照組的3倍[12]。

2.1.4體內研究除了以細胞為研究對象外，也有研究通過建立低水平鉛暴露模型分析宮內和哺乳期低水平鉛暴露對子代大鼠白細胞GRP78蛋白表達量的影響，探討鉛對內質網應激的影響，結果發現，母鼠從交配前30d起每天被灌胃1ml(10mg/ml)乙酸鉛溶液后，哺乳期低水平鉛暴露致使內質網應激的標志性蛋白GRP78蛋白表達增加；提示母鼠體內的鉛可以通過妊娠和哺乳輸送到仔鼠的不同器官，從而改變白細胞GRP78蛋白的表達；推測母源性血鉛濃度的升高可改變幼鼠白細胞中GRP78蛋白的水平，這可能是鉛影響免疫功能的機制之一[13]。

2.2鎘

2.2.1腎細胞Liu等[14]以LLC-PK1腎臟上皮細胞為研究對象評價了鎘對GRP78蛋白表達的影響，發現在用10μmol/L氯化鎘處理的細胞中，GRP78蛋白水平在6h開始升高，并持續升高到24h；當用1～20μmol/L的氯化鎘處理細胞6h，GRP78蛋白的表達呈劑量依賴性增加；同時，氯化鎘處理引起URP下游激活蛋白ATF4和磷酸化eIF2的增加。另外也有研究顯示，在腎小球細胞中，內質網應激的標志性蛋白GADD153的表達在鎘暴露后4h開始上調，內質網相關的凋亡基因Caspase-12及下游的Caspase-3在鎘暴露后16h被激活[15]。

2.2.2肝細胞以內質網應激反應性堿性磷酸酶(ERstress-responsealkalinephosphatase，ES-TRAP)為內質網應激發生的靈敏生物標志物，Hiramatsu等[16]分別從體內、體外兩個方面探討了重金屬（鎘、鈷、鎳等）和內質網應激的關系：在體外試驗中，以可以穩定表達ES-TRAP的大鼠腎臟NRK52E細胞和小鼠肝Hepa-1c1c7細胞為模型，給予氯化鎘處理6h后，發現鎘可以誘導內質網應激的發生，并且表明ES-TRAP作為重金屬誘導內質網應激發生的標志物比其他內質網分子伴侶標志物敏感；在體內試驗中，以ES-TRAP轉基因小鼠為模型，發現急性暴露氯化鎘6h以后，肝臟和腎臟GRP78蛋白的表達顯著增加，并在24h恢復到正常水平，同時，急性鎘暴露可導致血清ES-TRAP活力快速下降，與肝臟和腎臟中內源性內質網應激標志物的表達趨勢相反。

2.2.3其他研究有研究發現，15或30μmol/L鎘處理NIHSwiss小鼠胚細胞（NIH3T3細胞）3、6、9、12h后，可以引起內質網結構發生不同程度地改變，使Caspase-12被激活，且呈劑量-反應關系；并可抑制細胞基質內質網鈣-ATP酶活力，誘導細胞凋亡，提示內質網與線粒體共同參與鎘誘導的細胞凋亡[17]。

同時，有研究發現，甲狀腺細胞給予鎘一次性處理后，再連續進行鎘處理則可增強內質網伴侶蛋白GRP94的誘導表達，且明顯高于一次性預處理和空白對照，這可能與鎘預處理改變了細胞的敏感性，后續鎘的連續處理激活了細胞應激蛋白表達的鎘特異性通路有關[18]。另外，Schroder等[19]以寄居蟹皮海綿為研究對象進行0.01、0.1、1mg/L氯化鎘分別處理0.5、1、3、6d，發現寄居蟹皮海綿能夠蓄積大量的鎘，導致DNA單鏈斷裂以及上調GRP78蛋白的表達，并且都具有時間-和劑量-效應關系。

2.3汞和甲基汞

在體外的研究中，Qian等[7]用氯化汞（Hg）處理C6細胞7d，發現1μmol/L的Hg就可引起GRP78mRNA水平顯著性升高，達到對照組的2.5倍,但當處理濃度達10μmol/L時，GRP78mRNA水平顯示了下降趨勢；就GRP78蛋白水平而言，1μmol/L的Hg就可顯著增加GRP78蛋白含量，染毒濃度為10μmol/L的Hg則可使GRP78蛋白含量達到對照組的2倍；為進一步探討無機汞誘導GRP78表達的機制，該研究采用凝膠遷移實驗(EMSA)評價蛋白-DNA交互作用，發現經Hg處理細胞的抗氧化反應元件、激活因子和核因子KappaB(NF-κB)與相應蛋白的結合能力增強，而且由于這些因子與抗氧化有關，因而提示氧化應激參與了Hg誘導的內質網應激反應。有研究發現，在甲基汞暴露14～16h的凋亡細胞中檢測到Caspase-12被激活，并發現內質網應激在甲基汞暴露9h后發生，而在甲基汞暴露早期（2～3h）細胞內的活性氧增加，提示內質網應激是發生在甲基汞細胞毒性的晚期事件，并且氧化應激可能是誘導內質網應激的原因之一[20]。

2.4鋁

Ghribi等[21]研究發現，在兔腹腔注射含鋁25mmol/L的AlCl3溶液15d后，海馬GADD153和轉錄因子NF-K的核轉位增多；同時，在內質網和細胞核中，伴隨著這兩種蛋白的核轉位，Bcl-2的表達水平降低；該研究還發現，鋁暴露可激發內質網特異凋亡蛋白Caspase-12的活力。張勤麗等[22]研究發現，以0.5、1.0、2.0mmol/L氯化鋁能誘導神經元凋亡，并能引起內質網的變形腫脹及脫顆粒現象，提示鋁對內質網可產生應激效應。另外，在去除培養液中的鈣離子和使用鈣通道抑制劑的情況下，Snyder等[23]對麥芽酚鋁的肝細胞毒性進行了研究，結果發現，利用毒胡蘿卜內酯促進內質網中的鈣離子外流會降低麥芽酚鋁對肝細胞的損傷，從而提示內質網應激參與了鋁的細胞毒性。

3內質網應激與常見人體必需金屬的關系

3.1鐵

在生物體內，鐵是機體必需的微量元素，但鐵過量會引起組織損傷。Lou等[24]以大鼠為模型，每天腹腔注射葡聚糖鐵30mg/kg，持續9周，結果發現，與對照組相比，心臟和肝臟中GRP78蛋白表達量和Caspase-12活力上調；同時，一次性腹腔注射300mg/kg葡聚糖鐵，發現在心臟和肝臟中GRP78蛋白的表達也顯著上調，提示內質網應激在鐵引起的組織損傷中具有重要的作用。最近一項研究是以HepG2細胞株為模型，利用氧化型二硫蘇糖醇(DTT)和高半胱氨酸誘導其內質網應激來揭示內質網應激對鐵穩態相關基因表達的影響，發現伴隨著非折疊蛋白反應，由肝臟分泌的調節鐵穩態的肝臟抗菌多肽水平表現為二相性：在非折疊蛋白反應早期，肝臟抗菌多肽水平降低；在應激反應的持續階段，肝臟抗菌多肽水平提高；這證明了內質網應激對于細胞內鐵穩態的意義[25]。

3.2錳

Chun等[26]以500μmol/LMnCl2處理多巴胺能細胞株24h，結果發現，其誘導的黑質多巴胺能神經元SN4741細胞的神經毒性由內質網應激反應介導，誘導內質網的分子伴侶GRP78蛋白水平升高，同時，激活內質網的特異凋亡蛋白Caspase-12。Oubrahim等[27]發現，0.5和1.0mmol/L錳(Ⅱ)作用24h可引起NIH3T3細胞凋亡的過程中，有Caspase-12的參與；同時發現，在Caspase-12基因敲除后，在NIH3T3細胞中不發生凋亡，表明Caspase-12在錳(Ⅱ)引起的NIH3T3細胞凋亡中起關鍵作用。

3.3鉻

目前，對鉻與內質網應激關系的研究主要集中于對糖尿病的研究。一些研究發現，內質網應激參與了鉻提高機體糖耐量和減輕胰島素抵抗的機制。Sreejayan等[28]對肥胖小鼠進行D-型苯基丙氨酸鉻[Cr(D-phe)3]處理，結果發現，與空白對照組肥胖小鼠相比，處理組的內質網應激的下游蛋白(p-PERK、p-IRE和p-eIF2α)的表達量減少，提示內質網應激參與了鉻對胰島素抵抗的緩解作用；同時，該小組還研究了在毒胡蘿卜素誘導肌管產生內質網應激的情況下Cr(D-phe)3處理的影響，發現在Cr(D-phe)3處理后，內質網應激的標記物p-eIF2α的表達受到抑制，進一步提示調節內質網應激反應可能是鉻的保護作用機制。

4其他金屬

對于鈾和鎳等其他金屬與內質網應激的關系也有一些研究，但主要是描述內質網應激反應，未能進行深入的機制研究。貧鈾在軍事上的運用使得關于貧鈾毒性的研究越來越多，其中，Miller等[29]發現，5～50μg/ml貧鈾處理HepG2細胞48h，可以上調內質網應激的標志性蛋白GRP78的啟動子并具有劑量依賴性。鎳一般都是以鎳合金的形式被應用。有研究發現，鎳合金的毒性比組成它的任何一種金屬單獨的毒性都強，并且鎳合金的毒性存在一定的劑量效應，用不同濃度（0.5、1.25、2.5和5μg/ml）鎳暴露HepG2細胞48h，結果顯示，可以引起內質網應激的標志性蛋白GRP78和HSP70啟動子劑量依賴性的升高[29]。

5小結及展望

本研究從人體內非必需金屬到必需金屬兩個方面概述了內質網應激與其毒性的關系，提示了內質網應激在重金屬的毒性機制中起到一定作用。通過對鉛、鎘、汞、鋁、鐵、錳、鉻、鎳、鈾等重金屬毒性的比較，推測氧化性損傷、鈣穩態失調以及與GRP78等內質網分子伴侶的直接結合可能是重金屬誘導內質網應激的共同機制。實際上，重金屬誘導內質網應激有其共同特點，即在適應性調節階段或稱激發階段，無論是劑量-效應關系還是時間-效應關系GRP78蛋白表達水平與空白組相比都呈先上升后下降的趨勢。并且內質網應激通路中的下游蛋白p-PERK、p-eIF2α、ATF6等也呈現相應變化趨勢，早期或輕度的反應可以誘導保護性適應反應。但是如果持續的或劇烈的內質網應激也能夠激發程序性細胞死亡。內質網應激引起的程序性死亡機制是通過GADD153、CHOP和Caspase-12等介導的。但目前對于內質網應激在金屬毒性機制研究中的具體作用機制研究仍以體外研究為主，選擇各種金屬的靶器官或靶細胞進行系統的體內研究相對較少，這就限制了相關毒性機制研究的拓展，也不能明確內質網應激通路激活究竟是毒性的表現，還是對金屬毒性的保護性反應，因而內質網應激與金屬毒性的關系值得進一步研究，并且在研究方法上需要完善，也只有獲得良好的研究模型和可靠的效應評價體系，才能為內質網應激的人群研究提供足夠依據。