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作者：宋雁李寧單位：中國疾病預防控制中心營養與食品安全所北京

免疫毒理學是毒理學的一個重要分支，是研究外源性化學物、物理因素及生物因素對機體免疫系統不良反應及其機制的一門學科。在某些情況下，免疫系統是容易受到攻擊的靶器官，在其他器官系統尚未觀察到毒作用時，免疫系統可能已經受到損害，如免疫病理學改變、細胞免疫異常、體液免疫異常、特異性免疫改變或宿主抵抗力下降等。因此，免疫系統的效應變化是某些危害的毒理學安全性評價中較為敏感的指標，而選擇敏感的生物標志物檢測早期健康危害效應將會極大的提高安全性評價工作的科學性和效率。例如，美國有毒物質和疾病登記局(agencyfortoxicsubstanceanddiseaseregistry，ATSDR)在制訂砷、狄氏劑、鎳、1，2-二氯乙烷、2，4-二氯酚的安全限量時，就采用了免疫毒理學的安全性評價結果。20世紀80年代初，許多國家的相關部門相繼嘗試制定免疫毒性的評價策略。其中有關殺蟲劑和藥物的免疫毒性評價方案最早出臺。歐洲(歐盟、荷蘭等)和美國(美國環境保護署EPA、美國國家毒理學規劃NTP和美國食品藥品管理局FDA等)都進行了早期的免疫毒性試驗指南的制定。但由于免疫系統組成和功能的高度復雜性，以及免疫毒物毒作用的靶細胞和靶分子的多樣性，目前尚未有一種免疫毒理學試驗方法能夠從整體、細胞和分子水平全面反映外源性化學物對整個免疫系統的影響，因此國際上一般采用一組試驗多項指標來進行綜合評價。而且分級篩選的試驗方案也逐漸被多家國際機構所認可，成為免疫毒理學安全評價的精髓，目前各國將免疫毒理學安全評價方法的重點放在分級試驗策略的優化和國際間的協調統一上。

1美國的免疫毒性評價程序

1.1美國FDA的免疫毒性評價指南

1982年美國FDA頒布了紅皮書I，就免疫毒性評價而言，內容僅涉及在一般毒理學試驗中進行血液學指標、血生化指標以及免疫器官脾的組織病理學檢測。考慮到所要監管的產品可能具有免疫毒性，1993年FDA頒布的紅皮書II《直接食品添加劑和著色劑的毒理學安全評價指南》中將免疫毒理學安全評價方法納入其中。2007年修訂的紅皮書2000中免疫毒理學安全評價方法繼續采用1993年版的內容。該指南適用于食品添加劑、藥品、生物制品及醫療器械等的免疫毒理學安全性評價。在具體實施過程中，推薦采用個案處理原則。制定了標準試驗，同時建議根據具體情況選擇其他合適的試驗或指標。試驗分為兩個水平:水平I，無需向動物注射抗原，可以采用標準的毒理學試驗進行免疫指標的測定;水平II是免疫功能試驗，通常需要多個系列組，每個系列組用來進行不同的試驗。水平I包括基礎指標和擴展指標，基礎指標通過標準的動物短期和亞慢性毒性試驗測得(主要的免疫毒性指標包括血液學指標:白細胞數及其分類;血生化指標:血清總蛋白，白/球蛋白比;組織病理學:淋巴器官如脾、胸腺、淋巴結、骨髓等)，以及嚙齒類動物發育毒性試驗(包括:a.母體發病率和死亡率;b.組織病理學:胎體的肝臟、胸腺和脾臟;c.F1和F2代的血液學指標、血生化指標、組織病理學、器官重量和體重等);擴展指標:血液學指標中外周血或脾臟B淋巴細胞數、T淋巴細胞數和T淋巴細胞亞群分析;血生化指標如血清白蛋白、血清免疫球蛋白、補體、血清細胞因子如IL-1、IL-2和γ-干擾素、血清自身抗體水平等;組織病理學:動物脾臟以及淋巴結B淋巴細胞和T淋巴細胞的免疫組化，脾臟生發中心和動脈周圍淋巴鞘的精密測定，淋巴結中淋巴濾泡和生發中心的精密測定，胸腺皮質和髓質的形態學測定。體外免疫細胞的功能測定:NK細胞活性測定;B淋巴細胞和T淋巴細胞增殖試驗;巨噬細胞功能試驗;骨髓干細胞測定。水平II也包括基礎指標和擴展指標，基礎指標包括T細胞依賴性體液免疫應答、T細胞非依賴性體液免疫應答、遲發型變態反應等，擴展指標包括宿主抵抗力(PYB6腫瘤細胞、細菌、病毒、真菌和寄生蟲等)。

1999年美國FDA的醫療器械和放射健康中心(CenterforDevicesandRadiologicalHealth，CDRH)頒布了免疫毒理學試驗指南，這一指南用于指導醫療器械及組成成分的免疫毒理學評價，提出最佳的試驗方案。包括一個流程圖和三個表格。流程圖用于決定是否進行免疫毒性試驗(G95-1/ISO10993)，如果某種醫療器械與已合法上市的醫療器械的材料、與人體接觸方式、劑量和接觸時間一樣，或其有長時間使用歷史但無毒性結果，或文獻報道其無毒性，則不需進行免疫毒性試驗。如通過流程圖建議進行免疫毒理學試驗，則通過三個表格的指示來進一步選擇所要進行的免疫毒性試驗，對免疫抑制、慢性炎癥、超敏反應、免疫刺激和自身免疫進行評價。表格1列出根據醫療器械的材質、類型、與人體接觸途徑和時間選擇不同的免疫毒性試驗;表格2包括關鍵指標和非關鍵指標，組織病理學是炎癥和自身免疫的關鍵指標，而是免疫抑制、超敏反應和免疫刺激的非關鍵指標;體液免疫是免疫抑制、超敏反應、免疫刺激和自身免疫的關鍵指標，而是炎癥的非關鍵指標;T淋巴細胞免疫分析均為關鍵指標;NK細胞活性和宿主抵抗力僅是免疫抑制的關鍵指標;表格3則列舉了表格2中關鍵或非關鍵指標的具體方法。2002年美國FDA的藥物評價與研究中心(CenterforDrugEvaluationandResearch，CDER)公布了審查新藥的免疫毒理學評價行業指南。該指南較為全面和詳細，涵蓋了免疫毒性概念中的所有內容如免疫抑制、免疫原性、超敏反應、自身免疫和不良免疫刺激。免疫抑制篩選試驗首先進行標準毒性試驗，通過動物重復劑量試驗測定血液學指標、血生化指標(血清白蛋白和白/球比)、組織病理學(脾、胸腺、淋巴結和骨髓)、免疫器官重量和臟體比以及動物感染和腫瘤發生率;擴展試驗對免疫功能進行測定如對綿羊紅細胞的初級免疫應答、對綿羊紅細胞的次級免疫應答、NK細胞活性測定、細胞毒性T細胞殺傷試驗、遲發型變態反應試驗、宿主抵抗力試驗、骨髓祖細胞功能試驗、巨噬細胞功能測定、中性粒細胞功能測定、免疫細胞表型及標志物。免疫原性用于測定藥物引起免疫反應的可能性，但采用非臨床毒理學試驗手段仍困難重重，因此CDER未推薦明確的方法。超敏反應分為I型-IV型，該指南主要針對小分子藥物進行評價。

I型超敏反應的評價方法包括:主動皮膚過敏反應試驗、被動皮膚過敏反應試驗、主動全身過敏反應試驗。但上述方法對于確定是否具有潛在的I型超敏反應仍十分有限，并未正式推薦使用。目前尚無標準的非臨床試驗可以很好預測II型和III型超敏反應，但CDER認為如果病理學檢測結果顯示可能異常即推薦按照“個案處理原則”進行深入研究。IV型超敏反應推薦的方法包括:Buehler封閉斑貼試驗＞豚鼠最大值試驗(GuineaPigMaximizationTest，GPMT)＞局部淋巴結試驗。目前尚未制訂標準的試驗方法用于測定藥物的自身免疫毒性和不良免疫刺激。該指南同時提供了一個流程圖用于指導免疫毒理學評價方法的選擇，主要考慮了藥物的給予途徑、免疫抑制方面的證據、針對人群、針對的疾病、藥物代謝物是否在免疫系統有蓄積等因素。

1.2美國EPA的免疫毒性評價指南1982年，美國EPA最早出臺了農藥免疫毒性評價指引，要求對新農藥按照兩級篩選程序進行評價。但當時該指引所推薦的方法和動物模型沒有被標準化和驗證，是不成熟的。之后的十多年時間里多次對早期版本進行了修訂，曾先后提出了OPPTS800.3550、880.3800和870.7800等指南用以指導免疫毒性評價。1996年美國EPA修訂了免疫毒性試驗指南OPPTS800.3550，該指南主要針對農藥和有毒有害物質的免疫毒理學安全性評價。盡管超敏反應、免疫刺激和自身免疫也是免疫毒性的重要內容，但該指南僅限于免疫抑制。作為受試物免疫毒理學安全評價的I級篩選試驗，包括標準毒性試驗和免疫功能試驗。標準毒性試驗即進行動物重復劑量毒性試驗，小鼠和大鼠是首選試驗動物，可選擇單一性別的動物，但必須保證該性別動物對受試物更為敏感，每組動物至少10只，連續給予受試物至少30天。試驗設陰性對照組，陽性對照組，低、中、高3個受試物劑量組和1個衛星試驗組。測定血液學指標(白細胞數及其分類、紅細胞數、血小板數、血紅蛋白、紅細胞壓積)，血生化指標(血糖、谷丙轉氨酶、尿素氮、白蛋白、總蛋白等)，組織病理學(脾、胸腺、淋巴結、骨髓、肝、肺、腎、腎上腺、腦垂體、性腺)，免疫器官重量及其臟體比，脾、胸腺和骨髓細胞數和細胞存活率。免疫功能試驗中體液免疫包括抗體空斑形成細胞試驗、血清免疫球蛋白測定;細胞免疫包括混合淋巴細胞試驗、遲發型變態反應、細胞毒性T細胞殺傷試驗;非特異性免疫毒性試驗包括NK細胞活性測定、巨噬細胞活性測定。如果以上試驗出現一項陽性結果、結果無法解釋、有資料顯示該受試物具有免疫毒性或與其結構相關產品具有免疫毒性，均需進行II級篩選試驗。

隨后美國EPA公布了OPPTS880.3800，本指南為II級篩選試驗，如果OPPTS800.3550I級篩選試驗中細胞免疫或體液免疫出現異常則必須進行宿主抵抗力試驗，另外可采用其他的試驗如血清補體、抗體對T細胞非依賴抗原反應、T淋巴細胞和B淋巴細胞亞群分析、粒細胞功能測定、骨髓功能測定、細胞因子測定、空斑形成細胞反應、淋巴細胞對有絲分裂原的增殖反應、體內注射異源淋巴細胞后腘窩淋巴結增大反應、激素、免疫系統發育、巨噬細胞發育及其功能試驗。

1998年美國EPA制訂了OPPTS870.7800，該指南主要針對農藥和有毒有害物質重復暴露的免疫抑制評價。并且引入限制試驗的概念，即如果受試物經口攝入量至少1000mg/kg或經呼吸攝入量達到2mg/L仍未觀察到毒性反應，則不需設計3個劑量，只需依據人體暴露量進行較高劑量的試驗即可。小鼠和大鼠為首選試驗動物，可選擇單一性別的動物，但必須保證該性別動物對受試物更為敏感，每組動物至少8只，連續給予受試物至少28天。試驗設陰性對照組、陽性對照組和低、中、高3個受試物劑量組。進行免疫功能試驗如抗體空斑形成試驗、免疫球蛋白(SRBC免疫動物后4天測定血清IgM)、NK細胞活性測定、血液或脾T淋巴細胞和B淋巴細胞亞群分析等。

1.3美國NPT的免疫毒性評價指南

1988年LUSTER等提出外源性化學物和藥物小鼠免疫毒性評價方案，被美國多家毒理學機構及實驗室采用。此方案分兩級，第一級篩查可能的免疫毒性物質，包括七類十余項指標;第二級包括四類八項指標，對于第一級試驗中的一個或多個試驗有影響的化合物需進行進一步的試驗研究。

1.4美國NRC推薦的人群免疫毒性檢測方案

人群免疫毒性檢測對于確定外源化學物對人體健康危險度評價有十分重要的意義。上世紀80年代由美國國家研究委員會(NationalResearchCouncil，NRC)提出的人群免疫毒性檢測方案分為三級，所有接觸免疫毒物的人均需進行一級檢測，在一級檢測中發現有異常的所有人或選擇部分接觸人群進行二級檢測，如發現異常則需進行三級試驗。

2歐洲的免疫毒性評價指南

1983年歐盟首次提出對新醫療產品進行免疫毒性評價的意義和必要性，雖存在很多的不足，其僅對免疫器官進行組織病理學檢測，但引發了學術界和官方管理機構對新醫療產品的非臨床免疫毒性評價的廣泛關注。歐洲醫藥評價署(EuropeanAgencyforEvaluationofMedicalProduct，EMEA)的專賣醫藥委員會(CommitteeforProprietaryMedicinalProducts，CPMP)在1998年首次引入免疫毒性的新概念，即免疫毒性評價的重點不再局限于免疫抑制，明確強調藥物誘導的自身免疫和超敏反應也是免疫毒性評價的重點內容。2000年CPMP了重復劑量毒性試驗指南，其中第6部分對上述免疫毒性指導原則進行了更新，可適用于人用藥物如生物技術衍生物、疫苗、抗癌藥物等的毒性評價。一般選用兩種哺乳動物進行試驗，其中必須有一種為非嚙齒動物。試驗設陰性對照組、陽性對照組和受試物3個不同劑量組，試驗周期為28天。初級篩選試驗中進行血液學檢測、免疫器官重量及其臟體比、免疫器官組織病理學檢測、骨髓細胞數、淋巴細胞亞群分析和NK細胞活性測定。如任一結果呈陽性，則需進行體內或體外免疫功能擴展試驗如遲發型變態反應、淋巴細胞對有絲分裂原刺激的增殖反應、巨噬細胞功能試驗、對T細胞非依賴抗原的抗體反應以及宿主抵抗力試驗。

EMEA更名為歐洲醫藥署(EuropeanMedicinesAgency，EMA)于2005年加入了“人用藥物免疫毒性研究ICHS8”，并于2006年實施。

該指南用于對人用藥物的非臨床免疫抑制和免疫刺激的評價，而不包括自身免疫和超敏反應。值得一提的是，該指南并不適用于ICHS6所評價的生物技術衍生藥物和其他生物制品。試驗包括標準毒性試驗和追加試驗。2008年EMA下屬的人用醫藥產品委員會(CommitteefortheMedicinalProductsforHumanUse，CHMP)的“基因治療藥物臨床使用前的非臨床研究指導原則”也指出，有些基因治療藥物可能攜帶可編碼對免疫系統具有影響的生長因子、細胞因子或大分子的基因，要評價其免疫原性和免疫毒性需進行體液和細胞免疫功能試驗。

3日本的免疫毒性評價指南

在歐洲醫藥署和美國FDA的指導原則出臺之后，日本厚生勞動省(MHLW)于2004年了免疫毒性評價指南草案，基于這兩家機構的指導原則，MHLW也采納了分級篩選的評價策略。首先進行標準毒性試驗，通過動物重復劑量試驗測定動物體重及臟器重量(脾、胸腺、腎上腺)、組織病理學(脾、胸腺、淋巴結和骨髓)。如在常規免疫毒性試驗或其他研究中發現毒性時，需要在開始I期臨床試驗前進行初級抗體反應試驗并選擇性進行NK細胞活性試驗。如出現陽性結果時對免疫毒性進行深入研究，包括骨髓細胞計數，免疫細胞表型分析，血清免疫球蛋白，免疫組織化學，抗體水平，NK細胞活性，淋巴細胞增殖反應，細胞毒性T細胞殺傷試驗，血清補體，細胞因子，巨噬細胞或中性粒細胞功能試驗，遲發型變態反應，宿主抵抗力試驗，關節腔淋巴結反應(lymphnodereactionofarticularcavity)，速發型超敏反應，自身抗體，尿蛋白。MHLW也提出超敏反應的檢測方法包括GPMT、貼片試驗(patchtest)和Buehler試驗，可根據具體情況選擇不同的試驗組合:Draize試驗、佐劑和斑貼試驗(adjuvantandpatchtest)和Buehler試驗;弗氏完全佐劑試驗(Freund’scompleteadjuvanttest)、開放皮膚試驗(opencutaneoustest)、最優化試驗(optimisationtest)和裂口輔助試驗(splitadjuvanttest)。

4國際組織的免疫毒性評價指南

4.1ICH的免疫毒性評價指南

1997年國際協調委員會(InternationalConferenceofHarmonisation，ICH)制訂了人用藥物登記技術要求的生物技術衍生藥物的臨床前安全性評價指南S6［18］，其中涉及免疫毒性效應的有免疫抑制、免疫原性、自身免疫。考慮到藥物對人體產生免疫原性的可能性，應進行抗體反應試驗、抗體水平測定、補體活性試驗、免疫器官的組織病理學檢測。常規毒性試驗不足以對生物技術衍生藥物的免疫毒性進行評價，還應涵蓋體液免疫、細胞免疫等方面的內容。但這一指南并未系統提出免疫毒性評價的具體方法。2005年9月15日，ICH了專門針對免疫毒性評價的ICHS8指導原則即“人用藥物免疫毒性研究”，對于國際免疫毒理學來說是一個極具里程碑的事件。ICHS8將歐洲醫藥署(EMEA)、美國FDA藥品評價和研究中心(CDER)以及日本厚生勞動省(MHLW)三方關于免疫毒性評價的觀點中一致的方面統一起來，即關于免疫抑制和免疫刺激的評價。該指南主要用于人用藥物的免疫抑制或免疫刺激評價，但不適用于ICHS6中涉及的生物技術衍生藥物和其他生物制品的評價。初始篩選試驗包括對嚙齒類動物的標準毒性研究和非嚙齒類動物的慢性毒性重復試驗，試驗方法涉及血液學(白細胞數及其分類)、血生化(球蛋白和白/球比)、免疫器官重量和組織病理學、血漿免疫球蛋白、感染和腫瘤發生率。然后對初始篩選試驗結果、藥物藥理學特性、潛在目的人群、與已知免疫毒性物質的結構相似性、藥物在人體的分布以及臨床信息等因素進行權重分析，決定是否進行追加試驗。追加試驗包括T細胞依賴性抗體反應(TDAR)、免疫細胞表型分析、NK細胞功能、宿主抵抗試驗、巨噬細胞和中性粒細胞功能試驗以及遲發型變態反應(DTH)等。新的ICHS8指導方針指出如果恰當的評價標準試驗終點，可以檢測到大多數藥物的潛在免疫抑制作用。ICH三方關于免疫毒性指導原則的進度和方式各有不同。對于是否在常規的標準毒理學試驗中加入免疫功能性試驗存在爭議，只有EMEA要求常規篩選試驗中應包括淋巴細胞亞群分析和NK細胞活性的測定。2010年初ICH又了ICHM3，即“藥物在人體臨床試驗和上市授權前的非臨床試驗指引”，該指引在歐洲、美國和日本之間達到共識，并且希望能對藥物的非臨床試驗方法達成國際間協調，盡量減少各國和地區間的分歧。對免疫毒性評價仍采用個案處理的原則，并依據ICHS8指導原則進行。

4.2OECD的免疫毒性評價指南

目前為止，經濟發展和合作組織(OrganizationforEconomicCooperationandDevelopment，OECD)尚未單獨制訂免疫毒理學安全評價指南，但在后期修訂的一些非嚙齒類或嚙齒類動物28天經口毒性試驗、嚙齒類和非嚙齒類90天經口毒性試驗、慢性毒性試驗和致癌試驗等指南中闡明應觀察免疫系統的毒性反應。對免疫器官脾、胸腺和淋巴結要進行組織病理學檢測，這是免疫毒理學安全評價的一大進步，但遺憾的是缺乏必要的免疫功能檢測，而后者在預測免疫毒性方面更為敏感。

4.3WHO的免疫毒性評價指南

WHO也對人群免疫毒性檢測提出建議，WHO推薦的方案包括7個方面:血液學檢查、體液免疫、細胞免疫、非特異性免疫、淋巴細胞的表面標記、自身抗體、臨床化學檢查等。5我國的免疫毒性研究技術要求的現狀我國免疫毒理學的研究起步較晚，從70年代末以來有一些關于環境污染物、藥物、農藥和工業毒物等免疫毒性方面的報道。目前我國對外源性化合物的安全性評價中涉及免疫毒性評價的只有化學品毒性鑒定管理規范和中藥、天然藥物免疫毒性研究的技術指導原則，后者僅針對過敏性和光過敏反應;食品中僅保健食品檢驗與評價技術規范-2003年版中涉及保健食品增強免疫功能的評價方法;農藥登記材料要求僅包含了致敏性試驗。食品、農藥、有機物等物質毒理學安全性中均無免疫毒性的評價，這與國際趨勢和實際需要遠不相符，無法與其他國家或相關國際組織進行有效的驗證和比對，這不僅加大了我國在安全性評價方面的潛在風險，而且在一定程度上限制了我國在危險性評估方面的發展。隨著我國食品工業技術的發展和新資源食品開發力度的加快，不乏有一些外源性物質可能是以免疫系統作為靶器官，因此建立快速、靈敏的免疫毒理學安全評價的檢測方法迫在眉睫。6結語隨著現代毒理學研究技術和方法的發展，國際上的毒理學安全性評價理論和評價方法也不斷被完善，除傳統毒性試驗外，細胞毒理學、分子毒理學方法進入安全性評價體系中，根據受試物的特點選擇特殊的毒理學(如免疫毒理學)試驗已經作為常規的檢測和評價手段用于安全性評價中。目前，許多國家都已建立適合于本國的免疫毒性檢測方案，這些方案的檢測項目及內容還在不斷的變化與更新，但仍存在不少問題。ICHS8指導原則被推薦使用，標志著20多年來關于藥物免疫毒性問題的一系列國際活動取得明顯進展，免疫抑制的評價在歐洲、美國和日本間達成共識，但其適用范圍有限。就分級篩選機制而言，各國在一級篩選試驗中是否加入免疫功能指標也存在分歧，ICHS8和OECD認為在一級篩選試驗中未列入免疫功能試驗，而美國EPA、NTP和CDRH以及歐洲EMEA則認為免疫功能試驗的敏感性較好，在一級篩選試驗中除進行免疫病理學檢測外還應加入免疫功能指標。早期的免疫毒性評價方法主要關注免疫抑制，隨著免疫毒理學的進一步發展，免疫刺激、自身免疫和超敏反應也被列入免疫毒理學毒理學的范疇。因此，各國在制訂免疫毒性指南時逐漸考慮到了這些方面，但目前國際上就此尚未建立起較為全面的免疫毒理學評價方法。因此，全面、逐步、協調和個案處理策略仍是今后免疫毒理學安全性評價方法的主導原則。