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1cfDNA的相關研究

1.1cfDNA的存在形式目前發現cfDNA分子大小在0.18～21kb之間［9］，主要以核小體形式存在，也可存在于凋亡小體和微小顆粒(microvesicle，MV)中［3］，這些存在形式可防止其被DNA酶Ⅰ降解。cfDNA的存在形式不僅解釋了其穩定存在的機制，且為cfDNA有效收集和提取提供了實驗基礎。

1.2cfDNA臨床應用cfDNA在人體內分布廣泛，在臨床腫瘤、產前診斷和自身免疫性疾病等方面被廣泛研究和應用。Leon等［10］首先報道腫瘤患者外周血中存在較高水平的cfDNA，隨后多名學者分別進行了腫瘤與cfD-NA的相關性研究。Roth等［11］通過研究認為外周血cfDNA有可能成為肺癌新的微創診斷指標和風險評估工具。Lee等多名學者研究發現包括肺癌在內多種腫瘤組織細胞DNA與cfDNA存在一致的基因改變，提示外周血cfDNA甲基化與腫瘤性質有良好的相關性，可充當潛在的實時腫瘤標本用于腫瘤治療監測和預測復發的潛在指標。Fournie等［9］發現小細胞肺癌患者血中cfDNA濃度和神經元特異性烯醇酶活性顯著相關后，認為血中cfDNA可能來源于腫瘤細胞。Chiu等［14］報道母血中存在胎兒游離dna，使無創產前診斷成為可能。何小玲等對母血胎兒游離DNA用于無創產前診斷染色體異常疾病的準確性進行系統評價，認為該方法具有高精確性。Leffler等［16］研究表明系統性紅斑狼瘡患者由于DNA酶Ⅰ活性受損而不能及時降解死亡的中性粒細胞，過多的cfDNA可與蛋白質、脂類等形成復合物并在循環中長時間存在，可能會誘發自身抗體的形成。Li等［4］通過對36例無精子癥患者Y染色體微缺失診斷，發現精漿cfDNA和血液白細胞DNA完全一致，認為精漿cfDNA可作為無精子癥患者Y染色體微缺失無創診斷的備選途徑。

1.3cfDNA的檢測技術臨床中對cfDNA檢測輔助疾病診治主要基于PCR技術進行疾病相關基因的檢測，通過使用預先設計合成的引物對cfDNA進行特異性擴增，根據擴增產物的類型和數量，實現對疾病無創或微創的定性或定量檢測(如熒光定量PCR)。放射免疫法因其高靈敏度和高特異度亦是檢測cfDNA的簡便準確又靈敏可靠的方法，如首次報道腫瘤患者血液中發現cfDNA的Leon等就用的此方法。然而，人體內cfDNA水平受多種因素影響，該指標的改變無法對疾病(如腫瘤)的類型作出特異性的診斷，因此對cfDNA進行檢測的同時應結合其它的與疾病相關的標志物水平改變進行聯合診斷，可有利于提高疾病診斷的敏感性和特異性。

2cfDNA在法醫學中的應用

目前，關于游離mRNA分型用于在分子水平對斑痕類檢材來源的分析已有報道，但cfDNA在法醫學的應用卻少見報道。Diehl等［19］研究表明，游離DN段中只有相對少的片段中存在突變，大部分的DN段為野生型，Wu等發現血漿中的cfDNA長度可達21kb，這使得對cfDNA進行PCR-STRs分析存在理論可能性。陳陽等研究發現，同一個體的血漿cfDNA與血細胞DNA的15個STR分型一致，認為血漿cfDNA可作為一種有效的生物樣本進行STR分型檢測。國外多名學者研究接觸類檢材DNA多態性時，推測汗液中的cfDNA可能有助于痕量檢材的正確分型。Quinones等在80%的健康個體的汗液中檢測到了cfDNA，并認為cfDNA與細胞核DNA一樣可用于接觸類檢材DNA分型。Vandewoestyne等研究了多種斑痕和接觸類檢材中的cfDNA，發現痕量檢材分型時無論cfDNA和細胞核內DNA都可能出現等位基因缺失并且類型可能不同，建議將cfDNA和細胞核DNA分別提取并同時分析以保證分型完整與準確。臨床醫學中建立的cfDNA提取方法相對較多，除常規的有機溶劑法外，還有分離柱洗脫法、磁珠法、第二代測序等多種方法。但在法醫學實踐中，檢材中的cfDNA是極微量的，因此臨床中所用的cfD-NA的提取方法并不適用，往往需要改良，以降低檢材基因組DNA的損耗與污染。蘇恩本等研究孕婦外周血中胎兒cfDNA多態性時，對QIAampBloodMiniKit提取方法進行改良，用同一份DNA洗脫液洗脫多個DNA吸附柱以提高cfDNA的濃度，從而提高了母血中胎兒DNA的檢出率。由于cfDNA的分子大小在0.18-21kb且多以直徑小于0.22μm復合物形式穩定存在的雙鏈DNA，具有含量少、片段小的特點，因此可使用特定孔徑的濾膜或濾管選擇性的濾過cfDNA，以便與其它生物大分子分離，提高cfDNA的純度。Vandewoestyne等使用100K超濾管對斑痕類檢材浸液的cfDNA進行濾過富集后成功對多種斑痕類檢材cfDNA實現分型。然而，司法實踐中在對接觸類、斑痕類檢材的分型時，作為重要組成部分的cfDNA卻往往被丟棄，如采用Chelex-100法提取DNA過程中含有cfDNA的檢材浸液在離心后被棄掉。而對痕量檢材分型，特別是初次分型失敗(無擴增產物或出現等位基因丟失)的檢材，通過適當的方法收集并提取cfDNA，可增加檢材DNA產量，提高檢出率;同時將cfDNA分型與細胞核基因組分型同時進行分析有利于避免因等位基因丟失導致的分型錯誤，保證分型完整與準確。

3總結與展望

在臨床醫學中，cfDNA作為重要分子標志物應用廣泛，在法醫學實踐中的應用較少，但因其既可增加DNA產量同時能完善DNA分型，理論上可增加痕量檢材分型成功率，有較大潛在應用價值。然而，對cfDNA進行STR分型時仍面臨許多問題。健康個體不同組織和體液cfDNA含量差異較大，但總體含量偏少，更何況司法實踐中常見的痕量檢材，因此須選擇如試劑盒等適合痕量檢材DNA提取的方法，無疑增加了檢測難度和成本。同時，cfDNA往往與蛋白質、脂類等物質結合在一起形成復合物，僅少部分為游離DN斷，并不能通過離心簡單將cfDNA與細胞核DNA完全分離［24］。同時，腫瘤組織容易出現微衛星不穩定和雜合性丟失導致與正常組織STR分型不一致［27］，而腫瘤患者體內的cfDNA主要來源于腫瘤細胞，并且與腫瘤細胞DNA存在一致的基因改變，因此分析腫瘤患者cfDNA用于法醫學應格外慎重。雖然檢材中的cfDNA含量很低，但卻可能用于基因組DNA分型，為提高痕量檢材分型的成功率提供了新的思路。隨著DNA提取和分型技術靈敏度的提高，對cfDNA分型并用于司法實踐將成為可能，在痕量檢材分型實踐中將發揮重要作用。

作者：徐冬冬黃花張明陽杜冰王韻單位：川北醫學院法醫學系四川省南充精神衛生中心南通大學法醫系