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摘要：水中尸體的死因判斷一直是法醫學實踐中的熱點問題，而硅藻檢驗被認為是一種相對可靠的診斷溺死的方法。本文通過對國內外法醫硅藻研究進展相關文獻報道進行總結，綜述了硅藻檢驗在法醫溺死診斷中的應用，包括法醫學硅藻檢驗的發展歷史、意義及常用檢驗方法，即消化法、化學元素法、DNA分子生物學檢驗方法，通過對檢驗方法優、缺點的探討，對硅藻檢驗中存在的問題、發展方向進行了討論分析，以期待對溺死鑒定有所幫助和借鑒。

關鍵詞：硅藻；溺死；分子生物學；DNA檢驗；掃描電鏡

硅藻檢驗被公認是一種可靠的檢驗方法，可為水中尸體死因診斷、入水地點及死亡方式判斷提供強有力依據。筆者長期工作于公安一線，本文從刑事偵查及法醫學的角度，綜述硅藻檢驗在法醫學溺死診斷中的發展與應用，供同行借鑒。

1硅藻檢驗在法醫學溺死診斷實踐中的意義

1.1硅藻的生物學特性

硅藻是一種單細胞植物，其生物學特性，使其具有兩大特點：一是硅殼使硅藻不易受外界環境影響，可有效保存遺傳物質；二是硅藻外殼紋路具有特異性，便于區分種屬。

1.2硅藻的法醫學檢驗史

19世紀末，人們開始對溺死尸體進行硅藻檢驗。1904年，Revenstorf發現了水中的浮游生物可以通過溺液進入肺臟。1937年Kasparek消化法奠定了基礎。1951年，Weinig和Pfanz創立單溴苯染色硅藻檢驗法。1950年起，Auer等[1]開始硅藻檢驗的定性、定量研究。硅藻檢驗的法醫學價值得到全球多個地區專家的認可，在溺死診斷中占有不可忽視的地位。

1.3硅藻檢驗的法醫學原理及意義

1.3.1死亡原因的推斷生前溺死者在溺死過程中因主動呼吸，硅藻隨溺液進入肺泡，并穿透毛細血管壁進入體循環，到達全身各器官，甚至骨髓。而死后拋尸入水者，因缺乏上述呼吸循環運動，硅藻有可能進入呼吸道甚至肺，但無法進入體循環。通過溺死和非溺死者體內硅藻量的研究統計，二者有著明顯差異[2]。2018年，劉泉等[3]對100例大鼠溺死與死后入水進行對比，認為心、脾內的硅藻含量均與水中硅藻濃度成正比，更適用于溺死診斷檢驗。

1.3.2落水位置的推斷硅藻的生長繁殖與環境中光照、溫度、水體成分、水流速度、環境pH值等因素息息相關，因此不同水域中的硅藻種類和含量有很大差異。Ludes[4]利用尸體中硅藻進行落水點推斷的研究，取得了成果，對案件性質的推斷有著重要意義。

2硅藻檢驗方法

目前硅藻檢驗方法大致可以分為三類：消化法、化學元素法、DNA分子生物學檢驗法[5]。

2.1消化法

2.1.1無機消化法最初的硅藻檢驗方法有焚燒法、浸漬法、硅膠梯度離心法等[6]，主要通過簡單的焚燒或浸泡的方式檢測硅藻。1937年Kasparek創立濃硝酸法[7]，奠定了傳統無機消化法的基礎。此后，無機消化法進行了多次技術革新，從硝酸乙醇法[8]、硝酸乙醚法[9]，到濃硫酸濃硝酸過氧化氫法[10]，可以歸納為強酸加熱法，主要是在酸的種類、催化劑等方面進行改良，該類方法使硅藻檢出率大大提高，但存在一定危險性，對環境污染較大，因此該類方法已經逐漸被替代。在上述強酸消化的基礎上，1988年李延閣研制出“破機罐”法[11]使硅藻檢驗技術進入儀器設備化新篇章。此后出現了以微波加熱+壓力可控密閉消解罐為原理的微波消解儀[12]，并以此為基礎設計了微波消解+掃描電鏡聯用法[13]，該方法使用了微波消解法和濾膜富集技術，使有機物消解更徹底，有效提高了硅藻的檢出率，是目前被廣泛使用的硅藻檢驗方法，但該法檢驗成本較高，檢驗周期長，且對技術人員的能力要求高，因此不易在基層推廣應用，因此，王玉仲等[14]對濾膜進行透明化處理，可在普通光學顯微鏡下觀察硅藻，有效降低了檢驗成本。

2.1.2有機消化法相對于無機消化法，有機消化法更加溫和，對硅藻破壞度低，能有效保留其核酸物質，便于后續分子生物學檢測，但其消化能力有待進一步提高。有機消化法主要有Soluene-350消化法[15]及酶消化法[16]兩種。Soluene-350是一種含有四個銨離子的羥化物，其消化能力與強酸相當，但海水中的一些硅藻容易被Soluene-350消化，因此此法僅適用于淡水硅藻檢驗。此外，在Soluene-350消化法基礎上增加超聲波加熱程序可縮短試驗時間。利用蛋白酶K和SDS（十二烷基磺酸鈉）消化組織的方法稱為酶消化法，這一方法既可以檢測出硅藻，又可以檢出其他浮游生物，并且有效避免了強酸對硅藻的破壞。

2.2化學元素法

該方法主要通過紫外光激發水中浮游生物（包括硅藻）葉綠素a產生熒光，從而測算各器官中浮游生物含量，判斷水中尸體是否為溺死。此種檢驗方法操作簡單，污染小，成本低。但考慮到人體組織中其他熒光物質會隨著尸體在水中浸泡的時間延長而增多，因此存在檢測結果假陽性率高的風險。2.3分子生物學檢驗方法2.3.116SrDNA、18SrDNA和SSU基因的檢驗1996年Kane等[17]通過PCR法從已知溺死尸體的組織中擴增出藍藻16SrDNA，以此證明藍藻可隨體循環進入各器官中。2008年何方剛等[18]利用Nubel設計的特異性引物，擴增了三個不同水域的DNA、兩種水域中溺死的實驗動物肺組織DNA，發現溺死動物肺組織基因片段與該水域組的特異性基因片段存在相關性，與無關水域組的基因片段存在差別，從而表明通過PCR-DGGE檢測法檢測16SrDNA可以為判斷溺死點提供依據。2017年，Zhao等[19]通過對18SrDNA的V7區域進行焦磷酸測序(PSQ)，確定不同硅藻的相應分類群，進一步為推斷溺水位點提供依據。2013年，余政梁等[20]進行了動物實驗，通過檢測硅藻SSU片段，發現在溺死組動物組織中硅藻陽性檢出率遠遠高于非溺死組，認為該方法可以為溺死診斷提供有效依據。PCR-DHPLC法檢驗硅藻種類相對于消化法（如強酸-微波法）檢出率更高，降低了樣本的需求量。2.3.2葉綠素相關基因檢驗1）植物葉綠體1,5-二磷酸核酮糖羧化酶大亞基（ribulose-1,5-bisphosphatecarboxylase,rbcL）基因檢驗rbcL基因是植物葉綠體進行光合作用的關鍵基因片段，廣泛應用于植物和藻類的分類研究。2012年，Kathleen等[21]設計針對硅藻rbcL基因特異性引物，用PCR-DHPLC法成功檢出各類較少見的硅藻種屬。2018年，彭帆等人[22]檢測了21種標準藻株、3種人體共生標準菌株和人類DN段，驗證引物特異性和靈敏性，同時與電鏡下硅藻檢驗做了對比，結果證明，基于rbcL引物建立的PCR檢測法能快速檢測硅藻rbcL基因，所需檢材量少。可見，檢測硅藻rbcL基因的方法，在溺死的推斷中應用前景良好。2）纖細裸藻和肋骨條藻相關基因檢驗纖細裸藻（EuglenagracilisKlebs,EG）和肋骨條藻（SkeletonemaCostatum,SK）在各類水域十分常見，EG1、EG2、和SK1、SK2是葉綠素相關基因的表達產物，不存在于人體組織。2003年，Suto等[23]在溺死動物的肺、肝、腎中均檢出上述4種基因特異性DN段，為硅藻檢驗提供新方向。2008年，李小廷等[24]針對編碼EG1、EG2、和SK1、SK2相關基因，檢測溺死動物組織中的硅藻DNA，同時對比硝酸消化法檢測硅藻，結果證明通過檢測EG基因的方法檢出率要高于硝酸消化法，具有統計學意義。

3存在的問題及展望

3.1硅藻種屬的判斷

消化法聯合形態學觀察判斷硅藻種類準確度高，但消化法常對準確判斷存在諸多干擾，如無機消化法有可能會破壞硅藻形態，有機消化法有可能由于消化不完全掩藏硅藻形態，并最終導致部分硅藻種類遺漏。分子生物學檢驗方法中目的DN段較單一，靈敏度高，但較難提供準確硅藻種屬結果。如能尋找到特異性更高的基因片段，并建立更加全面的硅藻基因庫，則可為硅藻種屬判斷提供有效平臺。

3.2硅藻的定量

在實際硅藻檢驗中，各器官中的硅藻定量對于判斷死因是否為溺死至關重要，但目前的各種檢驗方式均存在不同的困難。以消化法中應用較為普遍的強酸微波消解電鏡法為例，無機消化法對硅藻破壞嚴重，硅藻碎片常難以準確計數，且肉眼觀察計數存在無法避免的誤差，因此無法精確統計硅藻數量。而有機消化法常存在消化不完全的問題，導致部分硅藻計數的遺漏。如何在保證硅藻形態完整性的同時建立自動掃描計數機制有可能成為硅藻檢驗的下一步研究方向。分子生物學檢驗方法的定量統計存在的問題主要是操作過程中樣本的損耗。

3.3硅藻的DNA檢驗方法

分子生物學檢驗方法仍有較大發展空間：首先，硅藻DNA檢驗片段較為單一，且硅藻DNA目前大多停留在共性DNA的檢測水平上，缺乏種屬特異性的檢測，下一步可以探索和研究硅藻種屬特異性的檢驗方法，同時綜合使用其他溺死相關浮游生物的特異性引物進行探索，使所檢測浮游生物種類更豐富，結果更精確，為溺死診斷提供可靠證據。其次，溺死尸體多為腐敗尸體，DNA可能存在降解，改良硅藻DNA提取、純化方法，提高DNA檢出率亦是未來發展的方向之一。綜上，硅藻檢驗的意義毋庸置疑，雖然目前該應用方法普遍存在成本高、對技術人員要求高、檢驗時間長、檢驗方法不成熟、環境污染等問題，但其已成為一種重要的技術方法，可為偵查辦案提供線索和證據，下一步還應盡快完善該檢驗技術方法的行業標準，指導公安實戰。

參考文獻

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作者：劉萌妍 趙偉 趙怡 單位：北京市公安司法鑒定中心