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20世紀末，隨著基于生長因子的細胞治療概念的提出［1］，血小板濃聚物的開發(fā)成為新的研究熱點。富血小板血漿(platelet-richplasma，PRP)作為第一代的血小板濃聚物，自1998年首次提出以來［2］，廣泛應用于促進軟硬組織的愈合再生，涉及整形外科、運動醫(yī)學、口腔頜面外科、牙周病學等多學科［3］。由于PRP在制備過程中應用牛凝血酶和氯化鈣對血液進行處理而存在潛在的免疫原性危險［4］，促使了更安全的第二代血小板濃聚物，即富血小板纖維(platelet-richfibrin，PRF)的產(chǎn)生，其最早由法國Choukroun等［5］提出。PRF制備簡單，無需對血液進行處理，在臨床上具有廣闊的應用前景。本文就近年來PRF在口腔醫(yī)學的研究進展作一綜述。

1PRF的制備

由Choukroun［6］提出的PRF(Choukroun''''sPRF)制備方法如下:抽取10ml靜脈血，立即在400g離心力下離心10min;離心后血樣分成三層:底層紅細胞層，上層無細胞血漿，中間層即PRF。由于血液收集后很快會凝固，所以獲得可用的PRF關鍵在于操作要迅速。臨床上常用兩層紗布輕柔擠出PRF中血清以獲得操作性能良好的PRF纖維膜。另一種PRF由美國CascadMedical的FibrinetPRFM設備生產(chǎn)，這種富血小板纖維制備技術需兩步離心、類似于PRP的制備技術。制備時雖不加牛凝血酶，但仍需加入檸檬酸鈉抗凝劑、分離白細胞的凝膠和氯化鈣，相較Choukroun''''sPRF制備昂貴且仍存在潛在的危險［7］。文獻中PRF這一術語通常就是指Chouk-roun''''sPRF，本文亦然。

2PRF的成分和結構

PRF為富含血小板和白細胞的纖維凝膠，其內含有多糖鏈和各種結構糖蛋白，如纖連蛋白、纖維原等。DohanEhrenfest等［8］測得血液中接近97%的血小板、大于50%的白細胞濃聚于PRF凝塊中。PRF內血小板和白細胞活化后能釋放出細胞因子，主要的血小板生長因子有轉化生長因子(transfor-minggrowthfactorβ-1，TGFβ-1)、血小板衍生因子(platelet-derivedgrowthfactors，PDGFs)和類胰島素生長因子(insulin-likegrowthfactors，IGFs)［9］;白細胞分泌的調節(jié)因子主要有白細胞介素(interleukin，IL)-1β、IL-6、腫瘤壞死因子(tumornecrosisfactor，TNF)-α等促炎因子和抗炎因子IL-4以及血管內皮細胞生長因子(vascularendothelialgrowthfactor，VEGF)［10］。DohanEhrenfest等［11］研究表明，PRF膜在7d內緩慢釋放約273．4ngTGFβ-1和50．3ngPDGF-AB;第一天釋放的量約為7d總量的40%，之后速度減慢，最后兩天釋放約占總量10%。而Su等［12］研究發(fā)現(xiàn)PRF制備5h后釋出液中的PDGF-AB、TGFβ-1、表皮生長因子(epidermalgrowthfactor，EGF)和VEGF總量能分別達到52．73ng、72．21ng、3．23ng和1．04ng，且前三種生長因子分別占血小板總容量的17%、55%和82%，而IGFs則保持在249．16ng。這與He等［13］研究結果基本一致，其證實PRF中TGFβ-1和PDGF-AB在7d內釋放的總量分別超過150ng和50ng，并且在28d后仍然能以ng水平大量釋放。盡管這些研究在具體數(shù)值上存在差異，可能與制備時所得的PRF量和檢測方法不同有關，但均證實PRF能長時間的釋放大量的生長因子，提示PRF應用于臨床時能使這些生長因子的作用更長久，而豐富的生長因子能加速組織的愈合和再生。組織學分析PRF凝塊表現(xiàn)為三個區(qū)域，即紅血栓區(qū)、無細胞纖維區(qū)和兩者之間富含血小板的血沉棕黃層，血小板主要集聚在紅血栓側，提示PRF凝塊近紅血栓的一側更具臨床應用價值;而多糖鏈則分布于纖維區(qū)，且隨纖維的網(wǎng)格狀結構走行，對小循環(huán)分子有高親和力，提示PRF具有支持細胞遷移和組織愈合的功能［9］。對PRF制備后析出的上清及釋出液進行生化分析，發(fā)現(xiàn)其中TGFβ-1、PDGFs、IG-Fs、IL-1β、IL-6、TNF-α、IL-4和VEGF的含量極低，說明這些生長因子主要存在于PRF中;而同樣進行凝膠電泳也顯示纖維蛋白原、纖維連接蛋白等參與纖維網(wǎng)架形成的蛋白缺失，提示多種多糖鏈、結構性糖蛋白是完全捕獲在PRF膜中的，說明PRF膜中含有豐富的纖維［9－10，12］。纖維在組織愈合過程中有重要的作用，損傷區(qū)周邊上皮細胞最終遷移至纖維基質，加速損傷軟組織的覆蓋;而在神經(jīng)血管化作用下，纖維能捕獲循環(huán)干細胞到損傷區(qū)，并為干細胞分化提供支持基質，提示PRF能保護損傷區(qū)、促進軟組織愈合，在組織工程中能支持移植的干細胞而促進組織再生。Kang等［14］分別觀察了新鮮的和凍干的PRF結構，在新鮮的PRF纖維區(qū)可觀察到大量的白細胞和血小板聚集，進一步證實PRF富含白細胞和血小板;而冷凍的PRF則顯示了其獨特的蜂窩狀結構，提示PRF有捕獲細胞的功能，可促進組織愈合。

3PRF體外研究

Dohan等［15］分別用四種人細胞在體外與PRF共同培養(yǎng)12h、24h、3d和7d，通過四氮唑鹽比色法(MTT)評估琥珀酸脫氫酶活性，檢測PRF對細胞呼吸的影響，結果表明PRF不影響細胞的琥珀酸脫氫酶活性，甚至使角質細胞和前脂肪細胞呼吸作用更好。該實驗證實PRF對人體無毒性，是一種安全的生物材料。PRF富含多種細胞增殖和分化所需的生長因子，能明顯促進口腔頜面部相關細胞的增殖和分化。Tsai等［16］研究證實PRF能刺激牙齦成纖維細胞、牙周膜細胞和成骨細胞的增殖，而對口腔上皮細胞的生長有抑制作用，提示PRF有促進牙周組織再生的潛能。DohanEhrenfest等［17］研究結果顯示，PRF能誘導牙齦成纖維細胞、真皮前角質細胞、前脂肪細胞和成骨細胞明顯而持續(xù)的增殖，在培養(yǎng)21d時細胞數(shù)可分別達對照組的2～3、1．5～2．5、1．5～3、2～5倍。該研究在分化條件下加入PRF培養(yǎng)成骨細胞，發(fā)現(xiàn)PRF同樣能促進成骨細胞分化，表現(xiàn)為堿性磷酸酶(alkalinephosphatase，ALP)的高表達和礦化結節(jié)的形成，而總DNA/蛋白比值增加說明在分化培養(yǎng)條件下PRF同樣能促進增殖。DohanEhren-fest［18］的另一研究同樣說明PRF能同時促進骨髓間充質干細胞的增殖和分化，且作用效果呈劑量依賴性。Gassling等［19］將人骨膜細胞定植于膠原膜BioGide和PRF膜中做細胞培養(yǎng)，結果表明兩組中均無死亡細胞;乳酸脫氫酶試驗中PRF所得數(shù)值約為BioGide的5倍，顯示較差的生物相容性;在四唑單鈉鹽法(WST)檢測中，PRF數(shù)值高于BioGide，顯示出較好的代謝活性;溴脫氧尿嘧啶核苷(bromode-oxyuridine，BrdU)試驗中BioGide和PRF與對照組的比值分別為0．89和1，掃描電鏡觀察到兩種膜表面均被細胞覆蓋，表明PRF較BioGide促增殖作用明顯。以上研究結果提示PRF可以作為促進細胞再生的支架材料用于骨組織工程。

4PRF動物研究

Lee等［20］在新西蘭白兔的右脛骨上將直徑為3．0mm的種植體植入3．0mm×5．0mm大小的骨缺損區(qū)。實驗組在種植體周圍的缺損區(qū)內加入PRF，而對照組不作處理，8周后處死白兔后發(fā)現(xiàn)實驗組新骨形成(29．30±7．50)%，而對照組僅為(11．06±8．94)%。實驗組的骨－種植體接觸比也較對照組高約22%。該研究證實PRF在小的骨缺損區(qū)有較好的促進骨形成的作用，提示臨床上可將PRF用于拔牙區(qū)或小缺損區(qū)，以減少這些區(qū)域的骨吸收。而Kang等［14］研究證實PRF在大面積鼠顱骨缺損區(qū)有明顯的促進骨再生的作用。毛晶晶等［21］研究證實PRF能在健康成年雜種犬上頜竇提升術中促進新骨形成，提高新骨質量。在該研究中，相較僅用羥基磷灰石(hydroxyapatite，HA)的對照組，植入HA-PRF復合物的實驗組在8周時即已出現(xiàn)明顯的新骨形成，12周時HA已大部分降解，大量成熟骨形成，可見較多的骨陷窩和哈弗系統(tǒng)。而Lee等［22］在新西蘭白兔的頂骨區(qū)制備雙側直徑為9mm的圓形缺損，右側植入酸消化后的絲蛋白和PRF，左側不作處理，12周后micro-CT示組織礦化度和礦化密度實驗組均較對照組高，組織學分析實驗組新骨形成較對照組高約10%。該實驗證實PRF與絲蛋白聯(lián)合應用能促進骨形成。這些研究說明PRF有明顯的骨誘導作用，在與骨替代材料同時使用時，能加速骨替代材料的降解和缺損區(qū)骨組織愈合。

5PRF與PRP的比較

PRP制備時需要2～3次離心［23］，加入氯化鈣和牛凝血酶后纖維才開始聚合，形成凝膠狀，這種快速聚合模式下形成的網(wǎng)狀結構十分堅固［6］，不利于細胞因子的捕獲和細胞的定植。PRF制備時無需加入任何添加劑，減少了PRF應用時潛在的免疫源性和疾病傳播的危險。PRF在一次離心的過程中，自然而緩慢的聚合成凝膠狀，所形成的纖維結構較靈活、彈性好，更易于捕獲細胞因子［6，9］。而且PRF通過紗布擠壓即可成膜，制備時間短，使用方便，價格低廉。PRF與PRP的主要成分都是富集的血小板和纖維蛋白原，富有血小板內的α顆粒中所含的多種生長因子。PRF含有血液中幾乎所有的纖維蛋白原［12］，而PRP中纖維蛋白的含量僅為2．5mg/ml［24］。因此，PRF較PRP含有更多的纖維蛋白原。Kang等［14］研究中比較PRF釋出液和PRP中生長因子與血管生成相關蛋白的含量，結果發(fā)現(xiàn)PRF中血管生成素(angiogenin)、胰島素樣生長因子結合蛋白-2(insulinlikegrowthfactorbindingprotein-2，IG-FBP-2)、胰島素樣生長因子結合蛋白-3、基質金屬蛋白酶-9(matrixmetalloproteinase-9，MMP-9)、絲氨酸蛋白酶抑制劑E1(SerpinE1)、金屬蛋白酶組織抑制因子-1(tissueinhibitorofmetalloproteinase-1，TIMP-1)、可溶性細胞間粘附分子-1(solubleintercellularadhesionmolecule-1，sICAM-1)、巨噬細胞移動抑制因子(macrophagemigrationinhibitoryfactor，MIF)和受激活調節(jié)正常T細胞表達和分泌因子(regulateduponactivationnormalTcellexpressedandsecreted，RANTES)高表達，而且MMP-9和SerpinE1是PRF中所特有的。其中MMP-9能促進細胞遷移，是人類牙槽骨骨髓干細胞的礦化的關鍵因素。肉眼觀PRF為光滑的淡黃色半透明固體、果凍樣，質韌有彈性;PRP為粘稠的紅色液體;凝膠狀的PRP質地松軟，易于與骨粉等物質混合。掃描電鏡觀察新鮮PRF纖維形成疏松多孔的網(wǎng)狀結構［14，25］，血小板聚集在纖維中央，其間有纖維穿行，周圍有許多血細胞，如紅細胞和白細胞。血小板內α顆粒大部分完整，部分與纖維緊密接觸的血小板膜消失，形成緊密接觸。PRP血小板聚集成簇，周圍散在白細胞。Pretorius等［24］用掃描電鏡觀察凝膠狀新鮮的PRP時發(fā)現(xiàn)PRP中細纖維稀疏的分布于粗纖維之間，血小板則以單一實體或聚集體存在。本課題組前期實驗研究結果(待發(fā)表)表明，PRP纖維短小、密集、直徑約90nm，纖維間孔隙直徑約0．5～1．1μm，似蜂窩狀;而PRF纖維粗大、疏松，直徑約160nm，孔隙直徑約2～4μm，交織成網(wǎng)狀。這些研究結果提示PRF可作為血細胞和生長因子的儲庫，能通過捕獲在纖維網(wǎng)格中的細胞和血小板，長時間的釋放生長因子。因而，相較于PRP，PRF更適合作為一種新的生物膜用于組織再生。

6PRF口腔臨床研究

6．1上頜竇提升

同種異體凍干移植骨(freeze-driedboneal-lograft，F(xiàn)DBA)作為移植材料用于上頜竇提升術時需要8個月的愈合時間，而有研究表明同時加入PRF時，愈合時間可減至4個月，證實PRF有明顯的促進骨形成的作用;該研究還發(fā)現(xiàn)上頜竇粘膜穿孔后直接用PRF覆蓋，并不影響最終的骨愈合，說明PRF用于上頜竇提升術時可防治上頜竇穿孔［26］。Antoine等［27］在20例病人中共植入35例種植體，種植體植入前，僅用PRF作為移植材料，填充提升的竇底，6～12周后安裝愈合基樁，制作種植體;根尖片顯示1年后竇底骨高度增加(平均約為3．2mm)，可見新生骨與竇底間有明顯的界限，盡管新生的骨量有限，但種植體成功率高達97．1%，僅一例種植體在安裝愈合基樁時脫落，該研究表明PRF對上頜竇底擴增移植后的骨再生有明顯的促進作用，且安全性高。

6．2上頜骨重建

Simonpieri等［28］將PRF和FDBA混合后溶入0．5%甲硝唑中用于種植術前上頜骨的重建，結果顯示:術后3d拆線，切口愈合良好，10周后種植前CT示移植材料形成整體，移植骨和剩余牙槽骨壁間放射學上完全同質。而隨后使用該重建技術的20個病人184例種植術的臨床研究發(fā)現(xiàn)，應用該技術無失敗病例，而且可觀察到PRF特別有利于骨膜愈合和成熟，具有更好的美學效果［29］。Choukroun［30］報道在上頜囊腫切除術中，切除囊腫后在遺留腔隙中加入PRF，能使空腔的生理愈合時間從6～12個月(平均10個月)顯著減少到2個半月。這些臨床研究結果證實，PRF具有促進移植骨成熟、提高新骨質量和加速骨生成的作用。

6．3牙周骨缺損

Sharma等［31］比較56例牙周炎骨內缺損病人，實驗組聯(lián)合應用翻瓣術和PRF，對照組僅用翻瓣術，結果表明:術后9個月實驗組探診深度比對照組低約1．3mm，放射線片示牙周附著水平較對照組高0．8mm左右，且實驗組缺損區(qū)平均骨填充量顯著高于對照組。該研究表明PRF能顯著促進牙周骨缺損的愈合，但仍需要長期、多因素隨機臨床對照試驗以進一步證實該研究結果。

6．4牙齦退縮

牙周炎病人常伴牙齦退縮，由于病人對美觀的要求越來越高，牙齦退縮已成為重要的治療問題。Anilkumar等［32］報道一例左下頜切牙牙齦退縮接近膜齦聯(lián)合的病例，在對該病人進行常規(guī)牙周機械治療后，將PRF覆蓋于暴露根面，再用側向復位瓣進行懸吊縫合;術后1個月隨訪發(fā)現(xiàn)無術后并發(fā)癥，6個月后根面得以完全覆蓋，移植組織形態(tài)及顏色均極佳。該研究為臨床提供了一種新的治療牙齦退縮的方法。Jankovic等［33］研究比較PRF和釉基質衍生物(enamelmatrixderivative，EMD)與冠向推進瓣聯(lián)合應用治療牙齦退縮，結果顯示兩者效果無明顯差異，12個月后PRF組牙齦退縮減少約3mm，角化齦寬度增加，疼痛較EMD組輕。這一研究表明PRF能促進軟組織愈合，減輕炎癥反應。

7問題和展望

PRF這種纖維蛋白現(xiàn)已廣泛用于口腔醫(yī)學，并取得了良好的治療效果。其富含白細胞，是一種免疫濃聚物，并且含有多種含量接近而作用拮抗的細胞因子，因而PRF的作用機制復雜，有待更深層次的研究。另外，PRF在俘獲細胞和促進細胞增殖分化方面具有特別優(yōu)異的作用，而且制備簡單、成本低、操作性能良好。因此，PRF在口腔組織工程上具有廣闊的應用前景。