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1材料與方法

1.1采集地點的選擇伊寧縣位于東經80°13′～82°42′，北緯43°35′～44°29′之間，東鄰尼勒克縣，西與伊寧市和霍城縣接壤，南鄰伊犁河，與察布查爾、鞏留兩縣隔河相望。同時，位于伊犁河谷中部，水草豐富，境內的伊寧口岸是伊犁地區重要的貿易口岸。

1.2實驗材料

1.2.1蜱的來源2013年4－5月，從伊寧縣的2個采集點、2個綿羊群，每群＞30只，均未藥浴，采集其體表寄生蜱，共獲得硬蜱324只，放置于潮濕陰暗處，以保持其存活。

1.2.2主要試劑PCR所用試劑均購自上海生工生物工程技術服務有限公司；DNA提取試劑盒（DNeasyBloodTissueKit）購自德國Qiagen公司；其他試劑均為分析純。

1.3實驗方法

1.3.1蜱種鑒定參照《中國經濟昆蟲志》［9］，用普通解剖顯微鏡將324只蜱進行形態學鑒定，初步分類后，從中選取50只用配備數碼照相功能的解剖顯微鏡（LEICAM165C）拍攝圖片，對蜱的盾板、假頭、假頭基、肛側板、氣門板、第一緣垛、孔區（雌蜱）等形態進行對比觀察并測量［11］。1.3.2蜱的處理和DNA提取將蜱標本分別依次用濃度為70%、50%、30%、10%的乙醇溶液于37℃搖床中振蕩沖洗1h，再用超純水反復沖洗，干燥。最后置于消毒滅菌的1.5mlEP管中。按照DNA提取試劑盒使用說明書提取蟲體基因組DNA，置-20℃保存備用。

1.3.3基因擴增用上游引物5′-CTGCTCAATGATTTTTTAAATTGCTGTGG-3′，下游引物5′-CCGGTCTGAACTCAGATCAAGT-3′擴增線粒體16SrRNA序列［12］；上游引物5′-CAAAAWCCTGGTAAAATTAAA-3′和下游引物5′-GCACTATCAAGCAACACGACT-3′擴增COⅠ序列［10］。25μlPCR反應體系：模板1.5μl（約50ng），上游和下游引物各0.75μl（75pmol），50mmol/LKCl，10mmol/LTris⁃HCl（pH8.3），1.5mmol/LMgCl2，1單位TaqDNA聚合酶。PCR反應循環參數為：①16SrRNA為94℃預變性5min，92℃變性30s，54℃退火30s，72℃延伸30s，共38個循環，72℃終延伸8min。②COⅠ為94℃預變性5min，92℃變性30s，50℃退火30s，72℃延伸60s，共38個循環，72℃終延伸8min。擴增片段后送上海生工生物工程技術服務有限公司測序。1.3.4序列分析及系統進化樹構建結合GenBank登錄的圖蘭扇頭蜱的16SrRNA和COⅠ參考序列，將本實驗PCR擴增的6條16SrRNA及6條COⅠ序列測序結果與參考序列比對，運用Mega5.0軟件的ClustalX程序分析，計算遺傳距離并構建遺傳進化樹。

2結果

2.1蜱種鑒定所鑒定蜱共324只（168♂、156♀），蟲體體型較小，雌蟲體長3.2～5.5mm，雄蟲體長2.9～3.6mm，呈褐色，背腹扁平似卵圓形，芝麻至米粒大，雌蜱飽血后可膨脹達蓖麻籽大。體分為假頭和軀體兩個主要部分（圖1A）。假頭基呈六角形，側角明顯，后緣微凹（圖1B）。雄蜱盾板覆蓋整個背部，雌蜱盾板覆蓋背前部，前部較窄，后部圓鈍，盾板遍布刻點，以細刻點居多，粗刻點少而零散（圖1C）。眼卵圓，靠近盾板前部邊緣。須肢粗短，中部最寬，前端稍窄。雄蜱氣門板長卵形（圖1D）。體端有緣垛，中垛大于邊垛，常有尾突（圖1E）。有肛溝，雄性肛側板后緣內斜明顯，內緣具角突，長約為寬的2.5～3.0倍，內緣中部稍凹，后緣向內顯著傾斜，其后方凸角明顯（圖1F）。結合有關文獻［9，13］認為伊寧縣的蜱具有硬蜱科扇頭蜱屬圖蘭扇頭蜱的特征。但由于吸血、飽血雌蜱及部分未成熟或形態變異的雄蜱，僅用傳統形態學分類方法不能準確區分。因此，從324只中選出6只雌雄分別具有形態差異的蜱（4♂、2♀），根據采集地點分別將其命名為YN-1、YN-2、YN-3、YN-4、YN-5和YN-6。YN-1為當地典型雄性圖蘭扇頭蜱；YN-2和YN-3為半飽血雌蜱，因其腹部吸血膨脹已無法觀察緣垛，肛側板和副肛側板難以區分形態且邊界不清；YN-4、YN-5和YN-6為部分形態特征改變雄蜱，YN4和YN5體端較寬似倒置三角形與典型的圖蘭扇頭蜱卵圓形體端不同，且YN5氣門板呈長逗點形與血紅扇頭蜱氣門板相似；YN6肛側板后緣圓鈍，凸角不明顯。因此對這6只蜱采用分子生物學方法進一步分析，對上述形態學鑒定結果進一步驗證。

2.2分子生物學鑒定

2.2.1PCR擴增通過PCR擴增上述形態學差異較大的6只圖蘭扇頭蜱線粒體DNA，產物經1%瓊脂糖凝膠電泳分析，均獲得特異性很好的PCR產物，與預期目的片段一致（16SrRNA約為460bp，COⅠ約為760bp）。

2.2.2圖蘭扇頭蜱16SrRNA和COⅠ基因片段組成利用Mega5.0軟件計算6只圖蘭扇頭蜱的16SrRNA和COⅠ基因片段堿基組成。16SrRNA基因片段A、T、C、G的平均堿基含量分別為36.68%、37.12%、10.7%和15.5%，堿基A＋T平均含量是73.78%。COⅠ基因片段A、T、C、G的平均堿基含量分別為38.56%、31.78%、14.12%和15.54%，堿基A＋T平均含量是70.34%。

2.2.3圖蘭扇頭蜱基因序列比對及系統進化樹運用Mega5.0軟件的ClustalX程序進行多重序列比對后，16SrRNA獲得2種不同序列，并登錄GenBank，登錄號分別為KF547987和KF547989；COⅠ獲得3種不同序列，登錄號分別為KF688136、KF688137和KF688138。各結合GenBank登錄的3種扇頭蜱的參考序列構建系統進化樹。6只圖蘭扇頭蜱16SrRNA基因片段的遺傳變異很小，共檢測出2個單倍型，1個變異位點。其中YN-2、YN-3、YN-4和YN-5序列相同，為一種單倍型；YN-1、YN-6在216位點處為轉換位點（T-C），為一種單倍型?；蛐蛄斜容^結果顯示同源性均在99.5%以上，遺傳距離為0.3%～0.5%。而上述6只圖蘭扇頭蜱的COⅠ基因片段序列變異較大，共檢測出3個單倍型，4個變異位點。YN-1、YN-2和YN-6序列相同，為一種單倍型；YN-3和YN-5檢測到3個變異位點，均為轉換位點（A-G），無插入/缺失和顛換現象；YN-4在上述變異基礎上，于574位點處發生轉換（A-G）?；蛐蛄斜容^結果顯示同源性均在98.6%以上，遺傳距離為0.3%～1.9%。

3討論

調查結果表明新疆伊寧縣綿羊體表普遍寄生了圖蘭扇頭蜱，據以往報道圖蘭扇頭蜱主要分布于新疆的巴楚、喀什、霍城、和田、哈密、呼圖壁、庫爾勒、輪臺、阿瓦提、沙雅、于田等荒漠草原和荒漠地區［14］。而伊寧縣地處亞歐大陸腹地，伊犁河谷中部，屬中溫帶干旱型內陸山地氣候，該地區氣候溫和，水源充沛，水草豐茂，以往并不適合圖蘭扇頭蜱的生存繁殖，而此次在伊寧縣發現圖蘭扇頭蜱分布普遍，可能與新疆北疆近30年雨水過少、特殊的植被分布及氣候改變有關。線粒體基因已成為群體遺傳學和進化生物學研究中的重要分子標記。Murrell等［15］認為線粒體基因對于分子進化的研究具有很大價值，且更適于種內遺傳差異的分析。目前蜱類研究中用的最多的線粒體基因為12SrRNA、16SrRNA、COⅠ和COⅡ等基因［10］。線粒體上的不同基因具有不同的解析功能，同一基因在不同的物種間也具有不同的解析能力。并且，在系統發育研究中多個數據比單個數據的效果要好，16SrRNA基因序列由于其保守性和存在的普遍性，被大量用于蜱類的物種鑒定和系統研究［12，16-17］。COⅠ基因是線粒體呼吸鏈末端的一個催化酶，比其他基因在生化功能的研究上更完備，普遍存在于真核生物和原核物細胞的線粒體中；此外，COⅠ基因是核基因組以外獨立的線粒體環狀DNA，所以能夠用來比較其在生物進化上的相互關系［18］。呂繼洲等［19］通過16SrRNA和COⅠ基因鑒定小亞璃眼蜱（H.anatolicum）、亞洲璃眼蜱（H.asiaticum）和殘緣璃眼蜱（H.detritum）3種形態上極其相近的蜱種。一般來說，在變異程度上16SrRNA基因較COⅠ基因明顯保守［20］，本實驗研究結果也證實了這一觀點。并且，通過對2個基因的研究發現，該地區圖蘭扇頭蜱種內遺傳差異顯著，證實圖蘭扇頭蜱具有生物多樣性。由于蜱傳播病原體一般與蜱種之間存在著一定的對應關系，親緣關系越近的蜱種，其傳播相同病原體的機會越大［21］。因此，不同蜱種的種內遺傳差異與蜱傳疾病的變化仍需進一步研究，為蜱媒病的預防控制提供依據。

作者：杜景云牟路萌張璘王麗娜王安東張科陳創夫王遠志單位：新疆石河子大學醫學院山東省濟南市中心醫院新疆石河子大學動物科技學院河南省平頂山學院新農村發展研究院