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1實驗方法

1.1指示菌的篩選唾液乳桿菌LH1F的新鮮菌液以2%接種量接種于10mLMRS液體培養基中，37℃培養24h，發酵液4℃下7000r/min離心20min，得發酵上清液。采用單層瓊脂平板打孔法檢測其抑菌活性：制備金黃色葡萄球菌、大腸桿菌CMCC44102、鼠傷寒沙門氏菌CMCC50115三種常見指示菌菌懸液（濃度為106CFU/mL），在無菌平皿中加入指示菌菌懸液1mL，倒入約20mL營養瓊脂培養基，混合均勻，待培養基凝固后，用直徑8mm打孔器均勻打孔，向孔內加入發酵上清液0.1mL，于4°C冰箱中擴散過夜后，37℃培養12h，測量抑菌圈的直徑（mm）。

1.2菌體細胞、有機酸及過氧化氫的排除實驗將唾液乳桿菌LH1F的發酵上清液用微孔濾膜（孔徑為0.22μm）的細菌濾器過濾去除菌體細胞；將無菌體發酵上清液用1mol/L的NaOH溶液中和至pH5.0；將無菌體發酵上清液經過氧化氫酶處理（酶濃度為10mg/mL，pH7.0，37℃水浴1h），將上述處理的樣品及唾液乳桿菌LH1F原發酵上清液、pH5.0的乳酸分別做抑菌實驗[8]，比較不同處理抑菌活性的差異。

1.3蛋白酶的敏感性將經胰蛋白酶（酶濃度為10mg/mL，pH7.0，37℃水浴2h）、胃蛋白酶（酶濃度為10mg/mL，pH3.0，37℃水浴2h）處理后的無菌體發酵上清液以及未經蛋白酶處理的無菌體發酵上清液檢測其抑菌活性的差異。

1.4唾液乳桿菌LH1F生理曲線測定唾液乳桿菌LH1F新鮮菌液以2%的接種量接種于150mLMRS培養基中，每隔2h（0~36h）取1mL發酵液置于離心管中，以MRS培養基作為空白對照，測量OD600nm值和pH，用各個培養時間的發酵上清液做抑菌實驗，測量抑菌圈的直徑。

1.5唾液乳桿菌LH1F產細菌素的初步純化向無菌體發酵上清液分別經30%，40%，50%，60%，70%，80%飽和度硫酸銨沉淀，4℃靜置過夜，4℃、7000r/min離心30min，收集沉淀，將沉淀重懸于原體積1/10的pH5.0，0.1mol/L的檸檬酸酸鹽緩沖液中，檢測鹽析上清液與沉淀復溶液的抑菌活性。將抑菌活性最高的沉淀復溶液經截留分子質量3ku的超濾離心管超濾[9]（5000×g，4℃）得濃縮液（M>3ku）及超濾液（M<3ku），分別取原液、濃縮液及超濾液測定抑菌活性。

1.6唾液乳桿菌LH1F產細菌素的生物學特性

1.6.1熱穩定性細菌素粗提液樣品分別于60℃、80℃、100℃、121℃條件下熱處理30min（121℃處理樣品置于烘箱，其余溫度置于電熱恒溫水槽），冰浴冷卻后，以未經熱處理的樣品為對照，進行抑菌實驗，比較抑菌活性的變化情況，確定該細菌素的溫度穩定性。

1.6.2pH穩定性分別取0.5mL的細菌素粗提樣品于離心管中，用1mol/LHCl和1mol/LNaOH分別調pH至2.0、3.0、4.0、5.0、6.0、7.0和8.0，37℃水浴2h后，調pH至5.0，以MRS培養基用1mol/LHCl和1mol/LNaOH調至相應pH作為對照，做抑菌試驗檢測抑菌活性的變化。

1.6.3蛋白酶敏感性細菌素粗提樣品用1mol/LHCl和1mol/LNaOH分別調至各酶的最適pH（胃蛋白酶pH調至3.0，胰蛋白酶、蛋白酶KpH調至7.0），加入酶的終濃度為10mg/ml，以同比稀釋的細菌素粗提樣品作為對照，37℃水浴2h，然后將pH調回至初始的pH，以未加入酶的發酵上清液作對照，分析該細菌素粗提樣品以不同蛋白酶處理后抑菌活性的變化。

1.6.4抑菌譜選取金黃色葡萄球菌、蘇云金芽孢桿菌、雞大腸桿菌O-78、大腸桿菌CMCC44102、雞白痢沙門氏菌C-79、鼠傷寒沙門氏菌CMCC50115、黑曲霉、根霉、青霉、啤酒酵母、紅酵母11株菌為指示菌，采用單層瓊脂平板打孔法分別對供試的菌株做抑菌試驗，測試細菌素粗提樣品的抑菌活性。

2結果與分析

2.1指示菌的篩選通過單層瓊脂平板打孔法檢測到唾液乳桿菌LH1F的發酵上清液對三種常見病原指示菌均有一定的抑菌性，結果見表1，金黃色葡萄球菌作為指示菌培養12h的抑菌效果最為明顯，但與大腸桿菌CMCC44102及鼠傷寒沙門氏菌CMCC50115的抑菌效果差異不明顯，因此以下抑菌實驗革蘭氏陽性菌采用金黃色葡萄球菌，革蘭氏陰性菌采用大腸桿菌CMCC44102作為指示菌，培養觀察時間為12h。

2.2抑菌物質性質的確定不同處理對唾液乳桿菌LH1F發酵上清液抑菌活性的影響結果如圖1所示：去除菌體細胞后，該發酵上清液的抑菌作用與原發酵上清液差別不大，說明發酵上清液中的抑菌性不是菌體細胞作用的結果；排酸作用后，該發酵上清液抑菌活性降低，但仍有一定的抑菌作用，而相同pH值的乳酸無抑菌活性，說明發酵上清液中還有其他抑菌物質存在；發酵上清液經過氧化氫酶37℃水浴1h處理后，抑菌活性比處理前的原發酵上清液小，但仍保留了較強的抑菌作用，說明發酵上清液中過氧化氫不是主要的抑菌物質，還有其他的抑菌物質存在。發酵上清液經過胃蛋白酶處理后，抑菌活性下降22.22%，發酵上清液經過胰蛋白酶處理后，抑菌活性下降了19.44%，抑菌物質對蛋白酶較敏感，說明抑菌物質為蛋白質類物質，初步確定為肽類細菌素。

2.3唾液乳桿菌LH1F生理曲線的測定將唾液乳桿菌LH1F的新鮮種子液按2%的體積比接種于MRS培養基中，37℃培養后每隔2h取樣，測定OD600nm值，pH和上清液的抑菌活性，該菌株的生理曲線（0~36h）的測定結果如圖2，菌株置于37℃培養，2~6h即進入對數生長期，12h左右進入穩定期。發酵上清液的pH在發酵2h后開始發生變化，2~8hpH迅速下降，從4.8降至3.5，8~20hpH緩慢下降，從3.5降至3.0，12h后恒定在pH3.0。在對數期生長前期（4h）開始產生細菌素，進入對數生長期（4~12h）后細菌素產量持續增加，培養16h的細菌素產量達到最大值，此時抑菌活性達到最高，隨后保持穩定，整個過程受pH的影響較小，結果表明唾液乳桿菌LH1F在對數生長前期就產生細菌素。

2.4唾液乳桿菌LH1F細菌素的初步純化硫酸銨沉淀后，分別用鹽析上清液和沉淀復溶液作抑菌試驗，結果如圖3所示，硫酸銨飽和度為30%及40%時鹽析所得的上清液均有抑菌效果，30%飽和度的抑菌效果比40%的好，而且30%飽和度鹽析所得的上清液抑菌效果比沉淀復溶液要好，說明30%飽和度硫酸銨不能較好地沉淀唾液乳桿菌LH1F所產的細菌素。隨著硫酸銨鹽飽和度的增大，沉淀復溶液抑菌效果增強并在60%時達到最佳，70%，80%飽和度時沉淀復溶液抑菌效果有所下降。因此，可以進一步確定抑菌物質主要為蛋白質類物質，鹽析的硫酸銨飽和度為60%時效果最佳。將所得的沉淀復溶液經截留分子量為3ku的超濾離心管超濾后，取原液、濃縮液及超濾液分別測定其抑菌活性。結果顯示，濃縮液的抑菌活性比原液（粗提液）強，而超濾液僅具有微弱的抑菌圈，表明絕大部分細菌素能被3ku截留分子量的超濾管截留。

2.5唾液乳桿菌LH1F產細菌素的特性研究

2.5.1熱穩定性唾液乳桿菌LH1F所產細菌素在不同的溫度下進行處理，檢測抑菌活性，熱穩定性實驗結果表明(圖4)，隨著溫度的升高，細菌素的殘余活性有所降低，但抑菌活性變化不是很大，樣品經60~80℃處理30min，抑菌活性保留95.9~91.8%之間；經100℃處理30min后，抑菌活性保留87.8%，而經121℃處理30min后，其抑菌活性仍保留在75.5%，該細菌素表現出良好的熱穩定性，與文獻報道[7]的唾液乳桿素均屬于第Ⅱ類細菌素（分子量小于10ku的小分子熱穩定肽）相符。食品加工中常用的巴氏殺菌條件為65~80℃15min，而此細菌素在巴氏殺菌的條件下仍保持90%以上的高活性，顯示出其在食品加工中的廣泛應用前景。

2.5.2pH穩定性pH穩定性實驗結果表明(表2)，唾液乳桿菌LH1F所產細菌素在偏酸的環境中有較強的抑菌性，活性pH范圍為2.0~5.0，pH越低，活性越強，pH為2.0時抑菌活性最強，當pH>6.0時，細菌素基本沒有抑菌性，說明所產細菌素在酸性條件下有較好的穩定性,，而在中性或堿性條件下即會失活。

2.5.3對蛋白酶的敏感性唾液乳桿菌LH1F所產細菌素樣品分別經不同的酶在37℃條件下處理2h，檢測抑菌活性，以確定該細菌素的蛋白酶敏感性。結果表明（圖5），樣品產生的細菌素對蛋白酶敏感，經胃蛋白酶處理后抑菌活性下降約35%，經胰蛋白酶處理后抑菌活性下降約30%，經蛋白酶K處理后抑菌活性下降約21%，說明該抑菌物質是蛋白類物質，可被蛋白酶降解而不會在體內殘留，作為食品防腐劑使用安全性相對較高。

2.5.4抑菌譜的測定用粗提樣品分別對供試的G+菌株、G-及部分真菌做抑菌實驗，結果表明（表3），唾液乳桿菌LH1F所產細菌索不僅對供試的1株金黃色葡萄球菌、1株蘇云金芽孢桿菌等革蘭氏陽性菌有較強的抑制作用，對2株大腸桿菌、2株沙門氏菌等革蘭氏陰性菌也有較強的抑制作用，但是對酵母菌及曲霉、青霉、根霉等霉菌未見有抑制作用。該細菌索有較寬的抑菌譜，不僅對芽孢桿菌、金黃色葡萄球菌等革蘭氏陽性菌有明顯抑制作用，同時對大腸桿菌、沙門氏菌等革蘭氏陰性菌也表現抑菌活性，可廣泛用于食品的防腐殺菌處理。

3結論

乳酸菌在代謝過程中除細菌素外，還能產生乙酸、乳酸及過氧化氫等具有抑菌活性的物質。唾液乳桿菌LH1F分離自從豬腸道內容物，其發酵上清液在排除菌體細胞、有機酸、過氧化氫干擾后，仍然保留較強的抑菌活性，經胰蛋白酶、胃蛋自酶處理后，抑菌活性降低，表明抑菌成分為細菌素。發酵上清液經60%硫酸按鹽析及超濾初步純化，特性實驗研究結果顯示：唾液乳桿菌LH1F產生的細菌素具有良好的熱穩定性，隨著溫度的升高，細菌素的殘余活性有所降低，但抑菌活性變化不是很大，121℃處理30min仍有保持75.5%的抑菌活性；在酸性環境下穩定，作用效果也較好，在中性或堿性條件下抑菌活性減弱或喪失，pH的活性范圍是pH2.0~5.0；對胃蛋白酶較為敏感，抑菌活性下降約35%，經胰蛋白酶處理后抑菌活性下降約30%，經蛋白酶K處理后抑菌活性下降約21%；唾液乳桿菌LH1F在對數生長前期就會產生細菌素，進入對數生長期后細菌素產量持續增加，整個過程受pH的影響較小；該細菌素具有較廣的抑菌譜，對供試的金黃色葡萄球菌、蘇云金芽孢桿菌等多種革蘭氏陽性菌及大腸桿菌、沙門氏菌等革蘭氏陰性菌抑制作用明顯，但對酵母菌及常見霉菌未見有抑制作用，具有作為食品生物防腐劑的潛在應用價值。該細菌素與上述報道的Ⅱb類唾液乳桿素具有一些共同特征，但是該細菌素是否一種新的Ⅱb類唾液乳桿素，還有待進一步的研究。

作者：李雪玲鄧綺敏羅少雯許瑞美羅奕慧胡文鋒單位：華南農業大學食品學院