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摘要：

目的：探討葡萄籽原花青素（grapeseedproanthocyanidinextracts，GSPE）對2型糖尿病大鼠認知障礙的影響。方法：Wistar大鼠隨機分為對照組、實驗組。實驗組大鼠采用鏈脲菌素聯合高脂飲食復制2型糖尿病大鼠模型。造模成功后，隨機分成模型組，二甲雙胍組（metformin，MET，140mg•kg-1•d-1，灌胃），GSPE低、中、高劑量組（GSPE1、GSPE2、GSPE3分別為20、40、80mg•kg-1•d-1，灌胃）。2個月后，觀察各組大鼠Morris水迷宮學習能力、海馬丙二醛（MDA）水平及超氧化物歧化酶（SOD）活性。結果：與對照組比較，模型組定位航行和空間探索能力下降（P<0.05）；MET組、GSPE3組定位航行學習能力和空間探索能力明顯高于模型組（P<0.05）。與對照組比較，模型組海馬SOD活性明顯降低（P<0.05），MDA含量明顯增加（P<0.05）；與模型組比較，MET組和GSPE3組海馬SOD活性顯著增加（P<0.05），MDA含量顯著降低（P<0.05）。結論：葡萄籽原花青素能改善2型糖尿病大鼠認知障礙，機制可能與增強SOD活性，清除過多的氧自由基，減少MDA的生成有關，并且葡萄籽原花青素的作用具有劑量依賴性。

關鍵詞：

葡萄籽原花青素；2型糖尿病；認知障礙；學習記憶

2型糖尿病（Type2DiabetesMellitus，T2DM）是當前我國發展最快和危害最深的一種代謝性疾病，常伴有逐年增加的認知障礙，主要表現為學習記憶能力的減退[1]。目前關于導致糖尿病認知障礙的機制有很多，公認的有氧化應激學說、神經元凋亡學說、炎癥學說等，其中氧化應激學說占有重要地位。氧化應激通過參與神經發生障礙，血腦屏障的變化，糖基化終產物生成增多及中樞神經細胞凋亡等多方面導致糖尿病認知功能的損傷[2-3]。因此，尋找一種具有抗氧化應激作用的藥物是減輕2型糖尿病認知障礙的策略之一。葡萄籽原花青素（grapeseedproanthocyanidinextracts，GSPE）是從葡萄籽中提取出來的一類屬于雙黃酮衍生物的天然多酚化合物，是一種高效的抗氧化劑和自由基清除劑，且容易透過血腦屏障[4-5]。因此，葡萄籽原花青素極有可能改善糖尿病病人的認知障礙。本研究旨在觀察不同劑量的葡萄籽原花青素對2型糖尿病大鼠認知障礙的影響，為葡萄籽原花青素的臨床應用提供實驗依據。

1材料

1.1動物及飼料健康3月齡雄性Wistar大鼠60只，清潔級，體質量為（195±16）g。常規飼料：57%碳水化合物，22%蛋白質，6%脂肪，8%纖維素，7%其它成分。高能飼料：60%常規飼料，20%蔗糖，15%豬油，5%膽固醇。動物及飼料均由川北醫學院醫學實驗動物中心提供。動物合格證號：SYXK（川）2013-076。

1.2藥物及試劑葡萄籽原花青素（天津尖峰天然產物有限公司，純度>95%）；二甲雙胍（上海醫藥有限公司信誼制藥總廠）；鏈脲菌素（STZ）購自sigma公司；超氧化物歧化酶（SOD）試劑盒（批號：20131009）與丙二醛（MDA）試劑盒（批號：20131016）均購自南京建成生物工程公司；快速血糖測定儀及試紙（三諾SXT-1型，長沙）。

1.3儀器Morris水迷宮計算機圖像實時分析系統（成都泰盟有限公司），HH.S21型恒溫水浴鍋（上海凱樂電子設備廠），752型紫外分光光度計（上海光學儀器廠）。

2方法

2.1動物模型制備T2DM大鼠模型建立參照本實驗室既往方法[6]。自由進食飲水，適應性飼養1周后，按體質量隨機分出對照組8只和實驗組52只。對照組采用常規飼料飼養。實驗組高能飼料喂養4周，空腹12h后一次性腹腔注射鏈脲菌素25mg•kg-1（注射前用pH=4.2的枸櫞酸緩沖液配成1%濃度）。對照組注射等量的檸檬酸緩沖液，實驗組繼續高能飼料喂養4周后，采尾靜脈血測空腹血糖（fastingbloodglucose，FBG），以FBG>7.8mmol•L-1作為2型糖尿病模型造模成功的判斷標準[7-8]。

2.2分組及給藥方法將成功造模的50只大鼠中隨機分成模型組，MET組（140mg•kg-1•d-1），低、中、高GSPE劑量組（GSPE1、GSPE2、GSPE3分別為20、40、80mg•kg-1•d-1），每組10只。GSPE1、GSPE2、GSPE3組每日灌胃給予葡萄籽原花青素。MET組每日灌胃給予二甲雙胍。模型組和對照組灌胃給予等容量生理鹽水，連續給藥2個月。各組大鼠在用藥期間自由飲水，進食。

2.3Morris水迷宮行為學測試給藥2個月后，參照Morris水迷宮法進行定向航行實驗和空間探索實驗，測試6d（繼續給藥），Morris水迷宮平臺固定置于第4象限中央，浸沒于水下2cm，水溫（25±1）℃。第1~5日進行定向航行實驗，每天分上、下午兩個時段，每個時段1次，分別從4個不同的標記點，將大鼠于象限邊緣中點頭朝池壁放入水中，記錄2min內大鼠從入水到爬上對角線象限的平臺所需時間（即逃避潛伏期）。第6日進行空間探索實驗，即撤去平臺，任選一個入水點將大鼠面向池壁放入水中，記錄2min內大鼠在各象限的游泳時間和跨越原平臺所在位置的次數。

2.4海馬組織SOD和MDA含量的測定Morris水迷宮行為學測試后，各組大鼠麻醉后斷頭取腦，并迅速取出海馬組織，濾紙吸干剪碎后置于勻漿機中，按照各試劑盒說明書要求進行檢測。

2.5統計學分析數據用x—±s表示，應用SPSS16.0統計軟件進行處理，對結果比較采用單因素方差分析，P<0.05為差異有統計學意義。

3結果

3.1一般情況觀察對照組大鼠一般情況良好，精神狀態佳，活動自如，毛發光澤，飲食及大小便正常，無死亡。模型組大鼠一般情況差，精神萎靡，活動減少，毛發晦暗，出現明顯的多飲，多尿，多食的癥狀。模型組大鼠因感染死亡一只。各給藥組上述情況均有不同程度改善。

3.2對2型糖尿病大鼠學習記憶的影響

3.2.1定位航行實驗各組大鼠平均逃避潛伏期隨著游泳天數的增加而不斷下降，說明各組大鼠游泳訓練期間學習尋找平臺的能力逐漸提高。第1、2天各組間差異不明顯，訓練后3d，與模型組比較，對照組大鼠平均逃避潛伏期時間顯著縮短（P<0.05）；與模型組比較，MET組、GSPE3組平均逃避潛伏期時間小于模型組（P<0.05），見表1。

3.2.2空間探索實驗對照組穿臺次數明顯多于模型組（P<0.05）；MET組穿臺次數明顯多于模型組（P<0.05）；GSPE3組穿臺次數明顯多于模型組（P<0.05）。

3.3對各組大鼠海馬組織中SOD活性和MDA含量的影響模型組與對照組比較，SOD活性降低，MDA含量增高（P<0.05）。MET組、GSPE3組與模型組比較，均降低了MDA含量，增加了SOD活性（P<0.05）。4討論2型糖尿病認知功能障礙是以獲得性認知行為缺陷為特征的糖尿病慢性并發癥。有研究顯示，2型糖尿病的早期階段就可有認知功能減退的表現[9-10]。本實驗結果顯示在成功復制2型糖尿病后2個月的模型組大鼠，Morris水迷宮檢測其空間學習記憶的能力已明顯低于對照組，證明2型糖尿病大鼠在早期即存在認知功能障礙，與文獻報道一致。用葡萄籽原花青素干預治療的大鼠空間學習記憶能力明顯高于模型組大鼠，顯示長期給予葡萄籽原花青素能很好的改善2型糖尿病大鼠學習記憶能力。目前研究表明氧化應激是導致2型糖尿病認知功能障礙的主要機制。氧化應激是指組織或細胞中自由基與抗氧化物比值的不平衡狀態。SOD是體內主要的抗氧化酶，清除超氧陰離子，保護組織或細胞免受氧化應激的損傷；MDA為脂質過氧化代謝產物，其水平增高時，可引起明顯的細胞或組織損傷。因此如果組織中的SOD活性增加，MDA含量減少就可以反映對細胞或組織的保護作用。目前已知海馬是人和大鼠學習、記憶有關的重要腦結構，并且海馬神經元在學習、記憶中起重要的整合作用[11]。因此本實驗選擇海馬作為觀察的靶點。

實驗中觀察到模型組大鼠學習記憶能力下降，并且海馬組織中SOD活性降低，MDA含量增加；而二甲雙胍組和葡萄籽原花青素高劑量組大鼠學習記憶明顯提高，同時能顯著提高海馬組織SOD活性，降低MDA含量。由此，可以推測2型糖尿病大鼠學習記憶的下降與氧化應激致使海馬受損有關。而葡萄籽原花青素能增加2型糖尿病大鼠海馬中SOD活性和降低MDA含量，減輕氧化應激的損傷，改善2型糖尿病大鼠學習記憶的能力。因此，證實猜測葡萄籽原花青素改善2型糖尿病大鼠海馬空間學習能力是通過調節氧化應激機制，減輕糖尿病認知功能的損傷，從而促進學習記憶的能力。

綜上所述，氧化應激所致海馬受損是2型糖尿病大鼠認知障礙的原因之一，葡萄籽原花青素可以通過提高2型大糖尿病鼠海馬SOD活性，降低MDA含量，減輕氧化應激損傷，從而提高2型糖尿病大鼠空間學習記憶能力。

參考文獻

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作者：劉行海 買文麗 鄭倩 劉華 張建武 劉紅 單位：川北醫學院