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【摘要】對共振光散射技術在藥物與生物大分子分析測定中的應用狀況及其進展進行了綜述。重點介紹了該方法在生物體液中藥物的分析和中藥成分的分析應用前景。為體內大分子藥物及其他藥物成分的檢測方法研究提供了新途徑。

【關鍵詞】共振光散射技術;藥物分析

共振光散射(resonancelightscattering，RLS)是利用普通熒光分光光度法對散射光進行測量的一種散射光分析技術[1]。該技術由于其簡單、快速、靈敏的分析特點，吸引了生命科學、分析化學、環境科學、材料科學等領域的分析工作者對其理論和應用進行了深入的研究，促進了分析學科內部各個分支之間的聯系，尤其是在生化領域已經取得一定的研究成果[2]。

光散射現象廣泛存在于光與粒子相互作用的過程中，當介質中粒子的直徑(d)與入射光波長(λ0)存在d≤0.05λ0時，產生的是以瑞利(Rayleigh)散射為主的分子散射光[3]。根據RLS理論可以得到散射光強度與散射粒子的濃度c成正比的關系，即IRLS=Kcb。據此可以用于大分子物質溶液的分析測定[1]。

RLS分析法靈敏度高，操作簡單方便，可通過普通熒光分光光度計同步掃描得到完整的RLS特征光譜和相應RLS峰。由于RLS法源于Rayleigh散射光吸收光譜，它對分子結構大小和形狀(如球形、鏈形、無規則線團等)、電荷分布、鍵合性質等研究還能提供新的、更豐富的信息。近年來的研究證明，RLS法還可用于痕量金屬、表面活性劑以及納米材料[4,5]等方面的研究測定。該方法一般不需要對樣品進行復雜的化學預處理，避免了一系列煩瑣的操作程序，而直接將處理好的樣品溶液置于普通的熒光分光光度計中進行測定即可。

1體液中生物大分子的測定

1.1蛋白質

蛋白質的功能很多，與生命的起源和生物的進化、細胞結構、病毒、免疫、酶、激素、物質的遺傳等有密切的聯系，它是生命現象的物質基礎。蛋白質定量測定是生物化學和生命學科中經常涉及的分析內容，在臨床醫學中也有重要應用。目前，蛋白質測定方法主要有Lowry法[6]，Bradford法[7]，Biuret法[8]，BromoeersolGreen法[9]與Bormophenolblue法[10]等。Pasetmack[1]將RLS技術用于測定微量蛋白質以來，RLS法分析技術以其方法簡單、快速、靈敏度高，在生物大分子分析測定研究中的報道日益增多，靈敏度可達納克級[11]。

黃承志等研究了陰離子表面活性劑羅丹明B(RhodamineB，RhB)與十二烷基硫酸鈉(SDS)?駁鞍字侍逑檔?RLS光譜特征。實驗發現，SDS與HSA(humanserumalbumin，HSA)結合后再與RhB作用，其散射光強度增強。且RLS增強的程度與蛋白的濃度在一定范圍內呈線性關系。據此，建立了一種測定人血清中總蛋白質的新方法[12]。胡之德等基于在pH2.11的酸性溶液中，聚乙二醇辛基苯基醚(OP)對亮麗春紅5R?駁鞍字侍逑檔?RLS信號有強烈的增敏現象，建立了OP?駁鞍字濕擦晾齟漢?5R三元體系測定人血清中蛋白質濃度的新方法。該體系對人血清白蛋白檢測的線性范圍在0.0～10.0pg?mL-1之間，檢測限為5.0ng?mL-1，檢測實際樣品的回收率在97.80%～109.62%之間，方法令人滿意[13]。王錫寧等利用RLS技術測定白蛋白、紅蛋白。研究了間苯二酚黃??OP?駁鞍字侍逑?RLS光譜特性，確定了在340.0nm處，pH2.40，間苯二酚黃濃度為2.3×10-5mol?L-1，OP的濃度為3.0×10-5mol?L-1時為最佳反應條件，據此建立了一種靈敏度高的測定蛋白質的新方法[14]。薛蓓等研究了流動注射(FIA)??RLS技術聯用在線測定人血清中蛋白質含量。以SDS為熒光探針，利用未曾報道過的RLS與FIA聯用檢測人血清樣品中蛋白質含量。與單純用RLS法測定比較，分析時間由40min縮短至1min，RLS信號的重現性得到了顯著改善，提高了實驗的靈敏度和重現性[15]。梁宏等在普通熒光分光光度計上選擇合適的激發光和發射光通帶寬度，利用RLS技術，研究了生理pH值(7.43±0.02)，25℃下，金(Ⅲ)與血清白蛋白的相互作用。首次觀測到金(Ⅲ)對血清白蛋白的RLS強度隨著金(Ⅲ)濃度增加而降低。結果表明，金(Ⅲ)與血清白蛋白的結合會破壞血清白蛋白分子聚集，使血清白蛋白中的二硫橋鍵斷裂，導致白蛋白分子趨于松散，散射截面積減小，表現為RLS強度降低[16]。

1.2核酸

核酸是遺傳信息的載體和基因表達的物質基礎，在生物的生長、發育等活動中具有十分重要的作用。目前核酸分析測定的方法主要有分光光度法、熒光光度法、化學發光法、探針技術法、免疫分析法等，其中分光光度法[17]和熒光光度法[18]使用較多。紫外分光光度法操作簡單，但由于靈敏度低，測定的干擾因素多，使其在應用上受到了限制;熒光分析法具有選擇性好和靈敏度高，但熒光試劑價格昂貴，而且部分熒光試劑有致癌活性。針對上述情況，RLS法因操作簡便快速，靈敏度高，試劑無毒性等優勢，在核酸分析中也得到了廣泛的應用。

黃承志等利用溴化十六烷基三甲銨(cetyltrime??thylammonsiumbromide,CTMAB)是陽離子表面活性劑，核酸因帶有大量的磷酸根而帶負電荷的特性，證明了CTMAB和核酸通過靜電引力共吸附到液/液界面上形成兩性復合物，導致強烈增加的全內反射共振光散射(totalinternalreflectedresonancelightscattering，TIR??RLS)信號，TIR??RLS信號強度與核酸的濃度呈線性[19]。劉紹璞等研究了5種陽離子表面活性劑與核酸反應的RLS光譜[20]。陳展光等首次利用諾氟沙星做為RLS光譜探針，測定了葉綠體脫氧核糖核酸(ctDNA)。在pH5.87的BR(Britton??Robinson)緩沖溶液中，波長405.5nm處出現最大RLS峰，ctDNA的線性響應范圍為0.02～2.30μg?mL-1，檢測限為1.2ng?mL-1。還合成了希夫堿試劑三??(2??(鄰羥基苯基亞甲氨基)乙基)胺，并且研究了其與核酸在鹽酸介質中的反應。對希夫堿劑三??(2??(鄰羥基苯基亞甲氨基)乙基)胺??DNA體系的研究發現，在393.0nm處增加的RLS強度與核酸的濃度成線性關系(ctDNA，0.01～4.50μg?mL-1;fsDNA，0.01～5.00μg?mL-1)。ctDNA的檢測限是1.4ng?mL-1，fsDNA的檢測限是2.1ng?mL-1。結果與紫外?部杉?分光光度法測得結果一致[21]。林楓等研究在pH4.0介質中加入DNA和陽離子表面活性劑可使二甲酚橙的RLS增強，據此建立了以二甲酚橙為分子探針測定DNA的分析方法，適用于合成樣品中的DNA測定[22]。

2在化學藥分析中的應用

黃承志等利用具有雙親性的RhB??CTMAB全內反射共振光散射法測定肝素，肝素通過與RhB和CTMAB相互作用形成三元雙親性的復合物RhB?哺嗡鬲?CTMAB，而被RhB和CTMAB協同吸附在水/四氯化碳(H2O/CCl4)界面上，引起強烈的TIR??RLS增強信號用于肝素的測定[19]。陳展光等在氧氟沙星?曹縊刈?3B體系中發現，pH5.09的BR緩沖溶液中，在439.5nm處，0.10～2.50μg?mL-1范圍內的氧氟沙星與增加的RLS強度成線性關系。與此同時，在pH6.90，405.0nm處，0.05～3.00μg?mL-1范圍內的氧氟沙星與RLS強度成線性關系，檢測限分別為0.013μg?mL-1，0.021μg?mL-1[21]。氧氟沙星?曹縊刈?3B體系可用于人體的氧氟沙星血藥濃度測定。還建立了人血清中抗菌類四季銨化合物的RLS技術檢測方法[23]。陳展光等，建立的二溴羥基苯基熒光酮(DBHPF)?睬?通(Triton)X??100?差獾墓艙窆饃⑸涔餛仔綠逑擔?分析測定了中藥、頭發以及水中的微量鉬[21]。劉云富等研究發現在硫酸介質中，砷鉬雜多酸與堿性染料RhB締合導致RhB體系的RLS強度減弱，在一定濃度范圍內，砷(Ⅴ)的含量與體系減弱的RLS強度成線性關系，據此建立了RLS技術測定砷(Ⅴ)的新方法[24]。

3在中藥分析中的應用

黃承志等，研究了熒光素(Flu)?殘￠藜?(BE)全內反射共振光散射法測定小檗堿。采用TIR??RLS技術通過Flu與BE在水/1,2,二氯乙烷(H2O/DCE)界面反應研究了BE在界面上的特性。Flu與BE形成雙親性的復合物，在H2O/DCE界面富集，并引起強烈增加的TIR??RLS信號，最大吸收波長位于373.0nm，所得信號強度在一定范圍內與BE濃度成正比關系，檢測限為1.3ng?mL-1。本方法與藥典使用的HPLC方法對照靈敏度有所提高[19]。張憶華等，在pH為10.0的Tris緩沖溶液中建立了綠原酸??CTMAB??ctDNA體系，實驗表明，440.0nm處增強的RLS光強度(ΔIRLS)穩定，在0.002～0.10μg?mL-1的濃度范圍內，體系ΔIRLS與ctDNA的濃度具有良好的線性關系，檢測限為0.6ng?mL-1。在厚樸酚??CTMAB??ctDNA體系中，選擇pH值為10.0的Tris緩沖溶液來控制反應體系的酸度，356.0nm作為定量分析的波長。在0.02～1.00μg?mL-1的濃度范圍內，ΔIRLS與ctDNA的濃度具有良好的線性關系。在最佳反應條件，320.0nm處，pH10.0時，兒茶素??CTMAB??ctDNA體系在0.02～1.00μg?mL-1的濃度范圍內，ΔIRLS與ctDNA的濃度成線性關系。類似的實驗還有山柰酚??CTMAB??ctDNA體系。此外，張憶華還研究了三價稀土離子與槲皮素、山柰酚所形成的絡合物的RLS光譜，研究了ctDNA對它的淬滅作用。建立了Tb3+/Eu3+?查紋に鬲?ctDNA體系以及Tb3+/Eu3+?采借頭營?ctDNA體系，結果表明，槲皮素與山柰酚通過配位作用與Tb3+/Eu3+結合，引起體系RLS光強度的增加，而當加入ctDNA后，體系的RLS光強度降低，原因是ctDNA結構中的磷酸骨架可以與Tb3+和Eu3+發生螯合作用，導致溶液中ctDNA和山柰酚與Tb3+/Eu3+的競爭配位。該方法取得了明顯的實驗成果[25]。新晨

4結語

由于RLS技術是建立在普通光譜法基礎上，分析結果雖然是物質的散射光譜信息，但物質形態特征等卻不能被獲取。基于此問題，一種結合顯微成像技術的共振光散射成像技術被建立起來，對生物大分子的聚集形態進行了深入的研究和探討[26]，儀器的性能和工作條件對所獲信號影響大。由于RLS光譜在較大光譜通帶下獲得，因而不利于光譜精細結構的研究。雖然我們知道散射光強度與散射粒子濃度有關，但出發點是從同步光譜開始的，顯然其測定公式推導并未涉及RLS的散射本質。因此，用于分析化學的RLS技術原理與定量基礎尚未有定論。雖然RLS技術作為一種新興的分析測定技術存在一些不足，但隨著RLS技術理論和應用上研究的深入，使RLS技術不斷朝著痕量、高效、微觀和自動化方向發展，極大地提高了RLS技術分析法的靈敏度，選擇性和特異性，應用領域不斷擴大。已報道的有關藥物的RLS分析方法主要涉及如下藥物：肝素[27]、地喹氯銨[23]、鹽酸小檗堿[28]、多糖[29]、蘆丁[30]、氨基糖苷抗生素[31]、青霉素[32]等。除了一些常規的測定藥物的RLS方法之外，近幾年還發展了以下幾種方法[12]：RLS成像技術、FIA??RLS技術、雙波長比率RLS技術等。RLS技術以其更靈敏、更方便，不需要熒光物質的特定體系等優勢，必將更好地為藥物分析測試服務。

【參考文獻】

[1]PASTERNACKRF,COLLINGSPJ.Resonancelightscattering:Anewtechniqueforstudyingchromophoreaggregation[J].Science,1995,269:935-939.

[2]HUANGCZ,LIKA,TONGSY.Determinationofnucleicacidsbyaresonancelight??scatteringtechniquewithα,β,γ,δ??tetrakis[4??(trimethylammoniumyl)phenyl]porphine[J].Anal.Chemistry,1996,68:2259-2263.

[3]HUANGCZ,LIYF.Resonancelightscatteringtechniqueusedforbiochemicalandpharmaceuticalanalysis[J].AnalChimActa,2003,500(1-2):105-117.