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作者：張王峰,付強,趙華棟,徐海峰，周潤鎖,袁夢暉,周飛華,南菁

【摘要】目的：探討中藥夏枯草對甲狀腺癌細胞株K1鈉/碘同向轉運體(nis)基因表達及攝碘率的影響，為夏枯草輔助放射性碘治療甲狀腺癌提供依據.方法：分別以不同濃度(0,20,50,100,150,200g/L)的夏枯草處理體外培養的甲狀腺癌細胞株(K1)，48h后利用半定量RTPCR檢測細胞NISmRNA表達，γ計數儀檢測細胞攝碘能力.結果：夏枯草濃度在0～100g/L范圍內，細胞NIS基因表達及攝碘能力隨夏枯草濃度的增加而增加(P<0.05).當夏枯草濃度達150～200g/L時，增加后濃度與100g/L濃度相比差別無統計學意義(P>0.05).結論：夏枯草可上調甲狀腺癌K1細胞NIS基因表達，增強其攝碘率，而且這種作用在一定濃度范圍內具有劑量依賴性.

【關鍵詞】夏枯草；甲狀腺腫瘤；腫瘤細胞；RTPCR；碘同向轉運體；攝碘率

【Abstract】AIM:ToinvestigatetheeffectoftraditionalChinesemedicinePrunellavulgarisontheexpressionofsodiumiodidesymporter(NIS)geneandradioiodideuptakeinthyroidcancercellline(K1),soastoevaluatethesignificanceoftraditionalChinesemedicinePrunellavulgarisinthetreatmentofthyroidcancerwithradioiodide.METHODS：Thethyroidcancercellline(K1)wastreatedwithtraditionalChinesemedicinePrunellavulgarisatconcentrationsof0,20,50,100,150,200g/Lfor48h.TheexpressionlevelofNISmRNAofK1wasdeterminedbyRTPCRanditsradioiodideconcentrationactivitywasmeasuredbyγcounter.RESULTS：TraditionalChinesemedicinePrunellavulgarisattheconcentrationbetween0and100g/LincreasedtheexpressionofNISgeneandtheradioiodideuptakeofK1.Therewasnosignificantdifferencebetween150-200g/Land100g/L(P<0.05).CONCLUSION：TraditionalChinesemedicinePrunellavulgariscouldincreasetheexpressionofNISgeneandtheactivityofradioiodideconcentrationofthyroidcancercellline(K1)inadosedependentmanner．TraditionalChinesemedicinePrunellavulgarismayplayaroleinthetherapyofthyroidcancer.

【Keywords】Prunellavulgaris；thyroidneoplasmstumorcells；RTPCR；NIS；radioiodideuptake

0引言

中藥夏枯草治療甲狀腺腫瘤有悠久歷史，目前多種專利報道的抗癌中成藥的主要成分也是夏枯草［1-3］.臨床治療中，甲狀腺癌對化療藥物不敏感，而放射性碘治療分化型甲狀腺癌療效確切.如何提高甲狀腺癌細胞的攝碘率是目前研究的熱點.鈉/碘同向轉運體(Sodium/IodideSymporter，NIS)基因被認為與甲狀腺細胞對碘的攝取有密切關系.本研究以人甲狀腺癌細胞系K1為研究對象，觀察了夏枯草對甲狀腺腫瘤細胞鈉/碘同向轉運體NIS基因表達及攝碘率的影響，從而探討夏枯草能否增加甲狀腺癌對碘的攝取以起到增加放射性碘對甲狀腺癌的療效.

1材料和方法

1．1材料NU2500型CO2培養箱（美國HUAIRE公司）；GU20低溫高速冷凍離心機（江蘇太倉醫療儀器廠）；SWCJIF凈化工作臺（蘇凈集團蘇州安泰空氣技術有限公司）；人甲狀腺乳頭狀癌細胞系K1（歐洲細胞培養中心），于飽和濕度、37℃，50mL/LCO2的條件下進行傳代培養；Na125I（成都中核高通同位素有限公司生產，放射化學純度99.7%無載體pH8.0）；DMEM培養基（美國Gibco公司）；小牛血清（杭州四季青生物材料工程有限公司）；Trizol（Gibco公司）；反轉錄試劑盒（Promega公司）；PCR酶為rTaKaRa(寶泰克公司)；PCR反應引物（北京奧科生物技術公司）.NIS上游引物序列為5′tggttaagggaccggaagacatc3′，下游引物序列為5′agttgcctactgcaatctacaagg3′，產物片段為342bp.GAPDH（3磷酸甘油醛脫氫酶），上游引物序列為5′AGGTCCACCACTGACACGTT3′，下游引物序列為5′GCCTCAAGATCATCAGCAAT3′，產物片段為310bp.夏枯草配制：40g夏枯草加水400mL，煮沸30min并過濾除渣，熬制濃縮液定容至40mL，濾液濃縮濃度為1g/mL，經120℃30min高壓滅菌后，用直徑為22μm的微孔濾膜正壓過濾，使用時用DMEM培養液稀釋至所需的不同濃度梯度.

1.2&nb

sp;方法

1.2.1細胞培養取對數生長期的細胞以1×108個/L密度接種于培養瓶中，24h后懸浮細胞貼壁，然后換以新的培養液加入不同濃度夏枯草（0，20，50，100，150，200g/L）.作用48h后收集細胞進行相應指標的檢測.

1．2.2RTPCR檢測NISmRNA的表達取1×108個/L細胞，加1mLTrizol裂解液于培養瓶中，用細胞刮勺將細胞充分刮下，轉入1.5mL離心管，室溫5min，加200mL氯仿，混勻，室溫5min，4℃離心，8000r/min，15min，將上清轉入新管，加5mL異丙醇，混勻，室溫10min，4℃離心，8000r/min，10min.去上清，加1mL750mL/L乙醇(DEPC水配制)，4℃離心，8000r/min，5min.去上清，沉淀物加去離子水溶解，讀取A260nm測量RNA濃度.每個樣品取1μgRNA進行反轉錄，于20μL反應體系中加入oligodT(500mg/L)1μL，細胞總RNA1μg，dNTP（2．5mmol/L）4μL，加水至12μL，65℃，5min.冰浴2min，短時離心后加入5×反應緩沖液4μL，0.1mol/LDTT2μL，RNaseOUT重組核糖核酸酶抑制劑(40U/μL)1μL，混勻，42℃，2min，加反轉錄酶1μL(200U/μL)，42℃，50min，70℃，15min后終止反應.PCR擴增在25μL體系中加入10×反應緩沖液2.5μL，dNTP(2.5mmol/L）4μL，模板(cDNA)2μL，上游引物與下游引物各2μL(10μmol/L)，PCRTaq酶1U，加水至25μL.PCR條件：以GAPDH基因表達產物為內參照進行半定量RTPCR，NIS循環參數為94℃預變性5min，繼以94℃變性30s，56℃退火30s，72℃延伸30s，35個循環后72℃延伸10min.GADPH循環參數為94℃預變性5min，繼以94℃變性30s，55℃退火30s，72℃延伸30s，35個循環后72℃延伸10min.各取10μLPCR反應液在10g/L瓊脂糖凝膠中電泳分離，EB染色后照相.KodakDigitalScienceID軟件系統掃描，測定光密度值并計算NIS／GAPDH光密度比值.其結果為3次重復實驗結果.

1．2．3γ計數儀檢測細胞攝碘能力夏枯草作用48h后收集細胞于小試管，調整細胞數，使每管的細胞個數為1×106個.離心棄上清，用PBS清洗兩次.向每個試管加入lmL含125I的HBSS溶液(含37kBq125I)［10］，將試管于37℃放置1h，離心去除上清液，用HBSS洗兩次.于γ計數儀檢測細胞的攝碘水平.

統計學處理采用SPSS10．0統計軟件.數據以x±s表示.計量資料比較采用t檢驗和方差分析處理.P<0．05為差異有統計學意義.

2結果

2．1RTPCR檢測NISmRNA經不同濃度的夏枯草處理48h后，K1細胞NISmRNA水平上調(圖1).當夏枯草濃度在0～150g/L范圍內，基因表達隨夏枯草濃度的增加而增加(P<0.05).當夏枯草濃度達200g/L時，NISmRNA的增加與前一濃度相比差別無統計學意義(P>0.05).

A：NIS的表達；B：GAPDH的表達.M：marker.

圖1RTPCR分析NIS基因在不同濃度夏枯草作用下的表達（略）

2．2γ計數儀檢測細胞攝碘能力20g/L的夏枯草作用后細胞攝碘能力便出現增強，隨著夏枯草濃度的增加細胞攝碘能力逐漸增強(P<0.05)，但150g/L濃度組與100g/L濃度組相比增加不明顯(P>0.05，圖2).

圖2夏枯草對甲狀腺癌細胞攝碘能力的影響（略）

3討論

研究報道單味藥夏枯草經水煎醇提法制成的夏枯草注射液對胃癌、大腸癌的體內外實驗表明夏枯草具有一定的抗腫瘤作用，可以改善病情，提高生存質量［4-5］.

鈉/碘同向轉運體(NIS)是存在于甲狀腺濾泡細胞基底側細胞膜上的一種糖化膜蛋白，即所謂的“碘泵”，其功能主要是將血液中的碘攝取入甲狀腺濾泡細胞內，以便合成甲狀腺激素.1996年，Dai等［6］首先從FPTL5細胞的cDNA文庫中克隆出鼠NIS基因，同年，Smanik等［7］用針對鼠NIScDNA序列的引物，經逆轉錄聚合酶鏈反應法擴增出人類NIS(hNIS)的細胞cDN段，隨后從人甲狀腺細胞cDNA文庫中克隆出hNIS.hNIS基因位于19號染色體上，整個編碼區由15個外顯子及14個內含子構成，其開放閱讀框架為1929個核甘酸，編碼643個氨基酸殘基［7］.研究發現［8］，在不同病理狀態下，甲狀腺組織NIS基因表達存在明顯差異.自主功能性腺瘤、Graves病和結節性甲狀腺腫患者NIS的表達增加.而在甲狀腺癌組織中，NIS的表達一般均低于正常甲狀腺組織.Franco等［9］利用RTPCR方法比較了正常甲狀腺組織與甲狀腺癌組織中NIS基因的表達，結果顯示，在甲狀腺癌組織中，NIS基因的表達普遍低于正常甲狀腺組織.甲狀腺癌組織NIS基因的降低導致其攝碘能力的下降.

文獻報道中藥能逆轉腫瘤細胞的惡性表型，中藥及其配伍對多種腫瘤細胞均具有一定的誘導分化作用［10］.本課題結果顯示經一定濃度的夏枯草刺激后，甲狀腺癌細胞系K1NIS基因表達水平及攝碘能力較對照組明顯提高.因此，我們認為K1細胞NIS基因表達、攝碘能力的提高是夏枯草誘導細胞分化的結果.

甲狀腺癌分化程度越高，攝碘能力越強.由于乳頭狀甲狀腺癌細胞具有一定的攝碘能力，因此利用放射性碘可進一步去除術后的殘余灶及轉移灶，從而大大改善甲狀腺癌患者的預后.但甲狀腺癌攝碘能力低于正常甲狀腺組織限制了放射性碘治療的臨床應用.本實驗結果顯示，甲狀腺癌細胞株K1經夏枯草處理后，NIS基因表達上調、細胞的攝碘能力增強，這一實驗結果為放射性碘治療甲狀腺癌

提供了新的思路.若能夠通過應用夏枯草的誘導分化作用，誘導NIS基因的表達，促進甲狀腺癌細胞向成熟階段分化，恢復或提高其攝碘能力，然后再結合放射性碘的聯合治療模式，則可能獲得滿意的臨床效果.但本實驗是建立在體外細胞培養的基礎上得出的結論，缺少體內研究結果的證實.其次，夏枯草誘導分化的機制尚不清楚，仍然處于實驗研究階段，缺乏進一步的臨床研究.今后應當進一步加強夏枯草誘導分化的體內的研究與臨床觀察，發掘中藥夏枯草在腫瘤的治療中作用.

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