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作者：王洋,戚好文，胡詠武,王勝春

【摘要】目的:觀察五味子醇甲（SCH）對肝纖維化大鼠枯否細胞（kc）釋放活性介質的影響.方法:分離、純化大鼠KC細胞并建立脂多糖(LPS)誘導KC細胞釋放細胞因子（TNFα，IL6,IL8）模型；制備及采用I125放射免疫法分別測定正常對照組、LPS模型組及SCH治療組的細胞因子水平；酶譜法檢測細胞培養上清谷草轉氨酶(AST),谷丙轉氨酶(ALT)的變化.結果:SCH治療組可抑制KC細胞分泌TNFα(21.2±6.3),IL6(0.17±0.01),IL8(0.8±0.1)等細胞因子（P＜0.05）.結論:SCH甲具有治療肝纖維化的作用.

【關鍵詞】五味子醇甲；脂多糖；枯否細胞；細胞因子；抑制

【Abstract】AIM：Toobservetheeffectofschizandrin(SCH)oncytokinesreleasedbykupffercellsinratswithhepaticfibrosis.METHODS:Kupffercellswereseparated,purifiedandinducedtoreleasecytokines(TNFα,IL6,IL8)bylipopolysaccharide(LPS).Cytokinesofcontrolgroup，LPSgroupandSCHtreatmentgroupwerepreparedandseparatelymeasuredby125Iradioimmunoassay.Alanineaminotransferase(ALT)andaspartateaminotransferase(AST)ofhepatocytesupernatantweredeterminedwithzymography.RESULTS：SCHsignificantlyinhibitedkupffercellsfromdeliveringTNFα(21.2±6.3),IL6(0.178±0.01),IL8(0.8±0.1)(P<0.05).CONCLUSION：Schizandrincanbeusedtotreathepaticfibrosis.

【Keywords】schizandrin;lPS;kupffercell;cytokine;inhibiting

0引言

中藥治療肝炎、肝硬化具有其獨到之處，因此長期以來是該領域的研究熱點.五味子為木蘭科植物五味子的干燥成熟果實.具有斂肺滋腎、生津斂汗、澀精止安、寧心安神的功效［1］.SCH（schizandrin，SCH）為五味子醇提取物，對化學毒物引起的動物肝細胞損傷有明顯保護作用,在治療急慢性肝炎方面具有顯著療效.但五味子醇甲對肝硬變的防治作用目前尚未見報道.已知細胞因子在肝硬變發生發展中起著重要作用,為此本研究針對肝硬變的特點，進行了體外五味子醇甲對大鼠肝枯否細胞（kupffercell，KC）分泌腫瘤壞死因子α(TNFα),白細胞介素6(IL6)與白細胞介素8(IL8)等活性細胞因子影響的研究.旨在初步揭示SCH抗肝纖維化的作用.

1材料和方法

1.1材料精密稱取1mgSCH，加DMSO0.1mL（sigma公司）溶解后，用4mL含100mL/L小牛血清培養液混勻，過濾除菌，即為200mg/L溶液.受試藥物濃度為100mg/L（預實驗證實）.

1.2方法

1.2.1枯否細胞分離與培養參照文獻［2］方法，取體質量150～200g，SD雌性大鼠3只（第四軍醫大學動物中心提供），250g/L烏拉坦麻醉后，小心游離摘取肝臟（勿使肝包膜破裂），置入Hanks液的培養皿中反復沖洗3次，剝離肝包膜，剪碎肝臟，過220目細胞篩，細胞用無血清培養液沖洗，混懸后1000r/min,離心5min，棄去上清；沉淀細胞用無血清培養液洗滌，1000r/min離心2次,每次5min，細胞重懸于200mL/L小牛血清培養液中，混勻后滴加于不連續梯度密度分離液上(1.053,1.058,1.080)，5200g（20℃）離心20min.小心吸取密度1.058以下分離液，收集的分離液3000r/min離心10min,沉淀細胞用200mL/L小牛血清培養液洗滌，3000r/min離心2次,每次10min，4g/L臺盼藍染色判斷活性.細胞重懸于200mL/L小牛血清培養液中，調整細胞密度1×1011個/L后，接種于培養瓶內,37℃,50mL/LCO2孵箱內培養，經反復傳代純化后開始試驗.

1.2.2建立脂多糖(LPS)誘導KC細胞釋放細胞因子（TNFα，IL6,IL8）的模型4組KC細胞培養于96孔培養板中，37℃,50mL/LCO2飽和濕度的培養箱中培養12h使細胞貼壁，每組分別用100,80,60,40μg/L的脂多糖（lipopolysacchide，LPS，SIGMA公司）孵育6,12,18,24h，吸去培養液，用PBS洗滌細胞1次；每孔加濃度5g/L的MTT染液20μL（溶于PBS中，濾過除菌，4℃避光保存）于37℃，50mL/LCO2飽和濕度的培養箱中繼續孵育細胞4～6h；加入新鮮配制的DMSO溶解MTT150μL/孔，水平搖床上搖10min，使還原產物充分溶解，酶標儀上570nm波長下測定光密度值.每試驗點重復4孔，優選出LPS作用KC細胞的最佳濃度及培養時間，據此最佳條件建立LPS誘導KC細胞釋放細胞因子的模型.

1.2.3實驗分組及各組細胞因子（TNFα，IL6，IL8）檢測取24孔培養板2塊，每孔加入8mm×8mm玻片1張后接種純化KC細胞懸液1mL（每mL含細胞數約1×108），置37℃，50mL/LC

O2孵箱內培養，待細胞長成單層后分設正常對照組、LPS模型組、SCH治療組，每組8孔.正常組、LPS模型組加完全培養液；SCH治療組加入濃度為100mg/L的供試液1mL，繼續培養24h，棄去上清后正常組加完全培養液；LPS組、SCH治療組各加60μg/LLPS的完全培養液1mL，繼續培養8h，收集各組細胞上清至-80℃保存，I125測定各組細胞培養上清中細胞因子TNFα,IL6及IL8的含量.

1.2.4SCH對細胞因子介導的肝損傷的作用按“1.2.1”方法制備KC細胞，調整細胞密度1×1011/L，置雙層培養小室下層，37℃,50mL/LCO2孵箱內培養，長至單層后進行實驗.取生長良好細胞分成3組：正常對照組、LPS模型組及SCH組.正常對照組、LPS模型組.制備方法同1.2.3.SCH組制備方法為生長良好KC細胞,用SCH供試液（100mg/L）培養.培養12h棄上清，正常對照組加完全培養液，LPS模型組和SCH組每孔各加60μg/LLPS供試液1mL，培養3h后終止.制備鼠肝細胞（HC）懸液，按密度1×1011/L加入上述各組培養小室上層內，每組6孔，每孔0.5mL，繼續培養8h后取上清液測定谷草轉氨酶(AST),谷丙轉氨酶(ALT).

統計學處理:使用SPSS10.0統計分析軟件，實驗結果以表示，組間比較采用單因素方差分析及LSDt檢驗，P＜0.05為差異具有統計學意義.

2結果

2.1不同濃度LPS對KC細胞活性的影響MTT結果顯示使用濃度為60μg／L的LPS孵育KC細胞培養12h時，KC活性最佳(圖1).

圖1不同濃度LPS對KC細胞活性影響（略）

2.2SCH對KC細胞分泌TNFα，IL6，IL8的影響與正常對照組相比，LPS模型組KC細胞培養上清中細胞因子水平升高(P＜0.05)，SCH治療組KC細胞培養上清TNFα和IL8水平較LPS模型組下降(P＜0.05,表1).

表1KC細胞上清中細胞因子的水平（略）

aP＜0.05vs正常對照；bP＜0.01vsLPS模型.

2.3SCH對肝細胞培養上清AST，ALT的影響與正常對照組相比，LPS模型組HC細胞培養上清AST和ALT水平升高（P＜0.05），SCH治療組HC細胞培養上清TNFα和IL8水平較LPS模型組下降（P＜0.05），接近正常對照組水平(表2).

表2復層培養條件下HC細胞上清中AST,ALT水平（略）

aP＜0.05,bP＜0.01vsSCH.AST：谷草轉氨酶；ALT：谷丙轉氨酶；LPS：脂多糖；SCH：五味子醇甲.

3討論

現有研究表明在多種因素誘發的肝損害過程中，均有激活的肝枯否細胞的介導及參與.KC細胞釋放TNFα，IL和蛋白水解酶等細胞因子，是該過程中的重要病理機制.高水平的TNFα可以誘導肝細胞凋亡［3］與壞死，TNFα尚能誘導KC產生自由基，對肝竇內的中性粒細胞具有趨化作用而進一步加重肝細胞損傷［4］.此外，TNFα又可誘導單核細胞和巨噬細胞產生IL8和IL6［5-7］.IL-6刺激肝細胞、枯否細胞分泌多種細胞因子，引發這些細胞因子的致纖維化作用.在感染、局部缺血、創傷及其它肝組織內環境失衡條件下，IL8的重要誘導劑TNF增高，導致IL8產生增多，直接損害肝細胞和加速病情惡化.

SCH為五味子醇提取物，對化學毒物引起的動物肝細胞損傷有明顯保護作用［8］，但對肝硬變細胞因子的影響尚未見報道.本研究首先建立脂多糖誘導大鼠肝枯否細胞釋放細胞因子（TNFα，IL6,IL8）模型，通過測定并比較正常組、LPS組和SCH治療組的細胞因子，結果發現與正常對照組相比，LPS模型組KC細胞培養上清TNFα和IL8水平升高（P＜0.05)，表明KC細胞經適宜濃度（60μg／L）LPS誘導12h后活性細胞因子的分泌增加，從而建立了本研究所需的細胞模型.另一方面，SCH治療組KC細胞培養上清TNFα和IL8水平較LPS模型組下降（P＜0.05），IL6有下降趨勢，提示SCH干預能減少KC細胞活性因子的釋放，但IL6水平降低不具備統計學差異，可能與因子調控的不同步性及LPS作用KC時間和所選濃度（60μg／L）有關.在上述模型的基礎上，進一步研究了細胞因子介導的肝細胞（HC）培養上清AST，ALT的變化.結果是LPS模型組HC細胞培養上清AST和ALT水平高于正常對照組，證實LPS誘導的KC釋放活性介質確對體外培養肝細胞有損害作用.SCH治療組HC細胞培養上清AST和ALT水平較LPS模型組下降，接近正常對照組水平，提示經SCH預處理的KC細胞具有抵抗LPS、減少肝纖維化因子損害及保護肝細胞的作用.

已有實驗表明肝纖維化患者的纖維化程度改善與IL6,IL8血清水平降低成正相關［9］；Pena等［10］發現經過還原型谷胱甘肽治療的肝纖維化患者血清中IL6和IL8水平明顯下降；Sener等［11］研究指出銀杏治療膽梗阻大鼠肝纖維化時，相比于正常組，治療組TNFα水平明顯降低.本研究初步提示SCH通過抑制枯否細胞釋放TNFα，IL6，IL8來保護肝細胞及減少肝損害的作用.鑒于肝硬化病變機制復雜，SCH對肝臟的保護作用有待深入探討.

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