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《分析測試技術與儀器雜志》2016年第2期

摘要:

建立了同時測定7種雌激素殘留的液相色譜－串聯質譜法．在最優條件下，待測物呈現良好的線性關系，相關系數均大于0．9957，檢測限介于0．5000～50．00ng/mL范圍．魚肉組織經C18小柱凈化濃縮，4．0mL乙腈－水(體積比5∶95，%)淋洗，2．0mL乙腈－水(體積比95∶5，%)洗脫．三類魚肉樣品中(鮦魚、龍膽魚、多寶魚)均檢出雙酚A和己二烯雌酚，部分樣品中檢出雌二醇和雌酮，加標回收率為85．70%～120．9%．方法快速、準確，適用于水產品中雌激素多殘留的高效測定．

關鍵詞:

雌激素;固相萃取;液相色譜;串聯質譜;水產品

雌激素是一類常見的內分泌干擾物，會擾亂機體內分泌物的正常生成、轉化、代謝和結合，造成生物體免疫、生殖功能異常［1－2］．近年來，避孕藥和畜牧養殖用藥使用量激增，在湖泊、河流、污水中均存在雌激素富集的現象，導致魚類出現嚴重性畸形［3］．對人類而言，雌激素通過食物鏈轉移，進入人體可誘發兒童性早熟，對成人生育功能也有影響，尤其對女性影響最為明顯，易造成流產、嬰兒出生缺陷等問題，甚至誘發卵巢癌、乳腺癌等疾病［4－5］．因此，雌激素對環境、生態和人類的影響備受關注，有必要建立靈敏、科學的方法分析雌激素．目前，雌激素多殘留檢測分析方法已有綜述［6－7］，主要包括氣相色譜［8］、氣相色譜－質譜聯用法［9－10］、液相色譜法［11－12］、液相色譜－質譜聯用［13－16］等．其中，液相色譜－串聯質譜(HPLC－MS/MS)以選擇性強、靈敏度高的特點，應用最廣．四級桿飛行時間質譜(QTOF－MS)靈敏、分辨率高、特異性強，基于碰撞誘導解析和二級質譜功能，提供化合物的結構斷裂原理，在雌激素等藥物殘留檢測中具有良好的應用前景．

1試驗部分

1．1儀器與試劑

1200系列液相色譜－6520型四級桿飛行時間串聯質譜儀(Agilent，USA);Milli－Q超純水系統(Milipore，USA);7018－00固相萃取裝置(JTBaker公司)．雌三醇(E3)、雙酚A(BPA)、雌二醇(E2)、2，4－二氯苯酚(2，4－dcp)、己二烯雌酚(DE)購自Sigma－aldrich公司，炔雌醇(EE)、雌酮(E1)購自德國DrEhrenstorferGmbh公司．乙腈為色譜純(Sigma－aldrich公司)，乙酸銨購自天津市福晨化學試劑廠，試驗用水為超純水．所有試劑使用前過濾．

1．2溶液配制及工作曲線繪制

標準溶液:準確稱取適量標準品，乙醇溶解，配制成1000μg/mL儲備液，4℃貯存．乙酸銨溶液:稱取0．77g乙酸銨，定容至1000mL，稀釋成5．0、1．0mmol/L溶液，用于后續試驗．工作曲線繪制:混合標準母液用超純水逐級稀釋，獲得一系列混標工作溶液．在最優條件下測定，根據峰面積與相應濃度的關系繪制工作曲線．

1．3液相色譜－質譜條件

色譜柱AgilentZorbaxSB－C18(Φ5μm，4．6×150mm);流動相為H2O(A)－乙腈(B)二元體系;梯度洗脫;流速0．4mL/min;進樣量8μL;柱溫35℃．質譜選擇ESI(－)和多反應監測模式;干燥氣溫度350℃、流速10L/min;霧化氣壓力0．276MPa;毛細管電壓3500V;碎裂電壓140V;2GHz動態拓展采集模式;m/z100－310．試驗所用氣體為氮氣(純度＞99．9%)，碰撞氣為高純氮氣(純度＞99．999%)．

1．4樣品處理

樣品提取:鮦魚、龍膽魚、多寶魚購自福州馬尾水產品批發市場．魚類去頭、鱗、骨及內臟，取魚肉組織，液氮中研磨成魚粉．稱取0．50g魚粉，加入5．0mL乙腈，超聲提取10min，10000r/min下離心10min，取上清液．殘渣再用2．0mL乙腈重復提取，合并兩次上清液．提取液用正己烷脫脂，每次用量3．0mL，重復操作二次，棄去正己烷，氮氣吹干，用2．0mLH2O溶解待用．固相萃取(SPE):BondElut－C18小柱(200mg/3mL，Agilent公司)用3．0mL甲醇活化、3．0mL水平衡，提取液過柱，4．0mL乙腈－水(體積比5∶95，%)淋洗、2．0mL乙腈－水(體積比95∶5，%)洗脫，收集洗脫液，氮吹濃縮，H2O定容至1．0mL，過濾后供HPLC－MS分析．

2結果與討論

2．1色譜流動相選擇

選定ZorbaxSB－C18色譜柱(Φ5μm，150×4．6mm)，考察乙腈－水、乙腈－1．0mmol/L乙酸銨及乙腈－5．0mmol/L乙酸銨作為流動相的效果，結果如圖1(a)所示．試驗結果表明，乙酸銨濃度增大，雌激素峰面積總體呈下降趨勢．故采用乙腈－H2O為流動相，此時色譜峰響應高、分離效果理想．在分離復雜混合物時，梯度洗脫能提高分析效率、改善分離度．嘗試了多種梯度方案對混合物分離的影響．結果發現，最優的梯度洗脫程序為:0～4．0min，維持65%B;4．0～4．1min，65%～97%B;4．1～8．0min，維持97%B;8．0～8．5min，97%～65%B，流速為0．4mL/min．在單次分析結束后，充分沖洗和平衡色譜柱．

2．2MS條件的優化

7種雌激素的化學結構式如圖2所示，其結構中含有不同數量的羥基或氯原子，首選ESI(－)檢測．為保證母離子良好的傳輸效率，優化了質譜碎裂電壓的影響，如圖1(b)所示．當碎裂電壓介于140～150V之間，大部分物質的響應值基本恒定，故選取碎裂電壓為140V．其他質譜參數的選擇是為了改善噴霧效果和電離狀況，提高方法的靈敏度．經優化，確定干燥氣溫度350℃，干燥氣流速10L/min．最優條件下，待測物在8min內實現分離，且形成很強的［M－H］－母離子峰和明顯的同位素峰(如圖3所示)．

2．3前處理方法探索

對比了兩種C18小柱的萃取效果．結果發現，ProElut－C18小柱對E3和BPA的回收率不理想(低于50%)．提取液經BondElut－C18小柱過柱，采用5%、10%、20%的乙腈－水溶液淋洗．乙腈含量越高，淋洗液的洗脫能力越強．5%乙腈－水淋洗時，后續檢測雜質稍多，但利用質譜提取離子功能，目標物測定不受影響且回收率較高．考察乙腈質量分數在80%～100%的洗脫效果．當乙腈質量分數低于90%時，后續濃縮步驟耗時長、回收率不高;乙腈質量分數為95%時的洗脫效果與100%乙腈接近，因此選擇95%乙腈將目標物洗脫．優化了洗脫液體積(1．0～3．0mL)，發現用量為2．0mL時，目標物回收效果較好．因此，BondElut－C18小柱以4．0mL5%乙腈－水淋洗，2．0mL95%乙腈洗脫．相較于液液萃取，SPE法操作簡便、節省有機溶劑．

2．4二級質譜解析

利用串聯質譜對分析物進行結構分析(如圖4所示)．E2、E3、EE和E14種組分具有相同母核，形成共同的碎片離子峰m/z145．0637(或143．0491)、183．0798，上述物質的斷裂原理與文獻［17－18］相符．BPA苯環側鏈上兩個甲基空間位阻大，推測丟失—CH3、—C6H6O、—C3H4等自由基碎片．2，4－dcp對應的碎片離子m/z124．9776、89．0034為連續丟失—Cl所得．DE是苯二烯類化合物，分別形成［M－H－CH3］－．、［M－H－C3H6］－．、［C6H5O］－．等碎片．后3種物質的多級質譜斷裂途徑鮮見報道(如圖5所示)．

2．5方法驗證

精確配制7種雌激素的系列標準混合液，考察線性關系，以3倍信噪比為檢測限，結果如表1所列．方法的檢測限為0．5000～50．00ng/mL，相關系數介于0．9957～0．9999范圍內．以200ng/mL標準混合液(BPA40ng/mL，EE400ng/mL，其余組分為200ng/mL)進行精密度試驗，連續5天進樣，日間RSD小于9．074%，表明方法穩定且重現，適合于7種雌激素的定量分析．

2．6魚肉樣品分析

魚肉樣品中雌激素的計算公式為:Cx=Ci×V/m，其中，Ci為各化合物質量濃度(由標準曲線計算，ng/mL)，V為樣品處理最后定容的溶液體積(mL)，m為魚粉質量(g)．試驗發現，魚肉樣品基質復雜，雖經SPE凈化，在質譜總離子流圖中干擾峰仍較多．利用QTOF質譜的提取離子功能結合保留時間、精確質量數等信息，3種魚肉中均檢出BPA和DE，部分樣品檢出E2和E1殘留(如表2所列)．向龍膽魚樣品添加兩個不同質量濃度的目標物，每個水平測定3份樣，計算回收率(如表3所列)．由表3可得，目標物回收率大于85．70%，RSD為0．8370%～3．568%，表明方法可靠，滿足分析檢測的要求．

3結論

建立了固相萃取－液相色譜－串聯質譜快速測定7種雌激素殘留的方法．結合Q－TOF－MS/MS定性精確、結構信息豐富的特點，推測了部分雌激素的裂解途徑．此研究能為水產品中激素類藥物殘留的快速鑒定提供分析手段，也有助于了解雌激素殘留分布的規律，為保證食品安全提供方法借鑒．

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作者:盧巧梅 單位:福州大學食品安全與檢測重點實驗室