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《分析科學學報》2016年第二期

摘要：

本文建立了膠束毛細管電泳測定竹蓀加工廢棄物的多糖組成的新方法?？疾炝司彌_溶液、表面活性劑、運行電壓、溫度等因素對分離效果的影響。選擇25mmol／L硼酸鹽（pH＝9．4）－20mmol／L十二烷基磺酸鈉（SDS）為電泳介質，分離電壓為15kV，分離溫度為25℃，9min中內可實現對竹蓀加工中廢棄物中多糖的單糖組分的分離檢測。

關鍵詞：

竹蓀廢棄物；多糖；膠束毛細管電泳；十二烷基磺酸鈉

竹蓀（Dictyophoraindusiata）別名“竹笙”，隸屬真菌門，是主要分布在我國貴州、云南等高山地區寄生在枯竹根部的名貴食藥兩用菌［1］，含有豐富的氨基酸［2］、多糖［3］、維生素，有“真菌之花”、“菌中皇后”的美譽。竹蓀子實體由菌蓋、菌裙、菌柄、菌托組成，由于菌托和菌蓋口感較差，在采收或加工商品竹蓀過程中被丟棄［4］，而菌托約占竹蓀鮮重的55％，菌蓋為鮮重的11％，即每生產出1000g的鮮商品竹蓀，就有1680g的菌托和331g的菌蓋被丟棄，造成該珍貴食用菌資源的巨大浪費。竹蓀多糖為具有生物活性的大分子物質，在抗炎癥［5］、抗腫瘤［6］、刺激免疫［7］、抗氧化［8］等方面都有顯著療效。以往對竹蓀多糖的研究主要采用氣相色譜［9］、液相色譜［10］和DNS比色法［11］對竹蓀子實體整體處理分析，或將研究局限在可食的竹蓀菌柄和菌裙部分，缺少對竹蓀不同部位多糖差異的對比分析，特別是缺乏對竹蓀加工中廢棄的菌托和菌蓋研究數據，不利于合理利用竹蓀資源。毛細管電泳作為一種快速、高效的新型分離分析技術［12］，在生物醫藥領域顯示了廣泛的應用前景。目前毛細管電泳法對植物細胞多糖的研究主要集中在茯苓［13］、防風［14］、藏紅花［15］等中藥材上，對竹蓀的研究較少。本研究采用1－萘基－3－甲基－5－吡唑啉酮對糖類物質進行柱前衍生，克服了傳統的還原氨化衍生法［16］存在的諸如反應時間長，不穩定基團易引起測定偏差等缺點。本實驗與Honda等［17］采用的單糖衍生試劑1－苯基－3－甲基－5－吡唑啉酮相比，采用的衍生試劑衍生化條件更為溫和，產物更穩定，靈敏度更高。同時本研究采用膠束毛細管電泳分離模式分別對竹蓀菌子實體四個部位多糖水解液的單糖進行了定性定量對比分析，9min內實現了樣品的快速高效基線分離分析。據此提出竹蓀加工廢棄物菌蓋、菌托綜合利用的可能性，以期為該資源的綜合利用提供基礎數據。

1實驗部分

1．1儀器與試劑毛細管電泳儀（美國，Agilent公司）；彈性石英毛細管：58．5cm×50μmi．d．（河北永年光纖公司）。單糖標準品：葡萄糖（Glc）、甘露糖（Man）、阿拉伯糖（Ara）、半乳糖（Gal）、巖藻糖（Fuc），1－萘基－3－甲基－5－吡唑啉酮（PMP），十六烷基硫酸鈉（SDS），十六烷基三甲基溴化胺（CTAB）。

1．2實驗方法

1．2．1標準溶液的配制稱取1－萘基－3－甲基－5－吡唑啉酮0．080g，定容至10mL，濃度為5．0×10－2mol／L。準確稱取葡萄糖、巖藻糖、半乳糖、甘露糖、阿拉伯糖標準品，配制成單糖濃度均為1．0×10－2mol／L的混合標準溶液。

1．2．2竹蓀樣品處理將竹蓀樣品按照菌蓋、菌裙、菌柄、菌托四個部位分類切割，并分別提取各部位多糖。多糖提取沿用香菇多糖的提取工藝，主要步驟為：干燥，研細熱水抽提，過濾，濃縮，Seveg法脫蛋白，乙醇沉淀，丙酮及無水乙醇分級洗滌竹蓀多糖制品。取上述竹蓀多糖5mg，加2mol／L的三氟乙酸1mL，封口后于100℃下水解9h，菌蓋、菌裙、菌柄、菌托多糖水解液分別標記為Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ號，冷卻后用氮氣吹至近干，用水溶解定容至1mL，備用。1．2．3衍生依次向安培瓶中加入100μL5．0×10－2mol／L衍生試劑PMP和10μL多糖水解液，10μL氨水，密封，于溫度80℃水浴中反應40min，取出用氮氣吹至近干，加1mL乙腈溶解后，備用。

2結果與討論

2．1電泳分離條件的優化

2．1．1緩沖溶液的選擇考察了鄰苯二甲酸鹽、乙酸－乙酸鹽、磷酸鹽和硼酸鹽緩沖體系，發現糖類衍生物在硼酸鹽緩沖體系中分離效果最好。固定其他條件不變，考察了硼酸鹽在15～30mmol／L時糖類衍生物的分離效果，發現硼酸鹽濃度為25mmol／L時，遷移時間較短，分離效率較高。選用能獲得最佳分離效果且時間相對較短的硼酸鹽溶液濃度為25mmol／L；調節緩沖溶液pH值為9．0～9．6，實驗結果表明，當pH為9．4時，分離效果最佳。進一步提高pH值，分離效率效果不明顯且極線漂移嚴重不利于分析測定。綜合考慮，選擇緩沖溶液pH為9．4。

2．1．2表面活性劑的影響選擇適當的表面活性劑可以起到改善電滲流［18］，提高分離效果的作用。實驗比較了CTAB、SDS兩種表面活性劑對分離的影響，加入表面活性劑CTAB對分離沒有明顯作用，加入表面活性劑SDS，出峰時間明顯提前，峰形改善明顯，但是高濃度的SDS導致基線噪音增加。實驗選擇SDS濃度為20mmol／L。

2．1．3分離電壓的影響實驗比較了電壓在12～16kV時對分離的影響。結果表明隨著分離電壓的增大，遷移時間明顯縮短，分離度有所增加；但分離電壓過高，電流增大，產生較大的焦耳熱，盡管縮短了分析時間，但組分間的分離度相應變差。綜合整體的分離情況，本文選擇的分離電壓為15kV。

2．1．4溫度對分離的影響維持恒定的毛細管溫度對于逸散毛細管電泳分離過程中產生的焦耳熱、改善分離都有一定的作用。在溫度為25～30℃范圍內，比較了不同溫度下單糖的分離情況。結果發現，溫度的變化對分離度的影響不大。為防止溫度過高產生較大的焦耳熱影響分離效果，選擇分離溫度為25℃。

2．2方法驗證配制系列濃度的單糖混合標準溶液，分別進行衍生化及電泳分析，并以單糖的濃度（X）對峰面積（Y）進行線性回歸。結果表明：在5～100μmol／L線性范圍內，峰面積和每種分析物濃度之間有很好的相關性。在信噪比為3的基礎上，5種分析物的檢出限為0．81～1．60μmol／L。各單糖的分析特性見表1。在最優化條件下，對單糖標準品衍生液的遷移時間和峰面積重現性進行考察，結果表明各單糖峰面積相對標準偏差（RSD，n＝6）均小于2．6％，遷移時間RSD均小于1．8％，表明方法的重現性較好。為驗證該方法的精確性，用標準加入法向竹蓀實際樣品加標，按1．2方法衍生化，在最優化條件下做回收率實驗，平行三次實驗，各單糖回收率在94．3％～103．4％之間，結果顯示該方法對于上述分析物的同時測定是比較準確的。

2．3方法應用按前述優化條件，對單糖衍生物標準品進行膠束毛細管電泳分離，結果見圖1。竹蓀多糖水解液Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ按1．2方法衍生化，典型電泳譜圖見圖2（Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ）。采用標準加入法，將實際樣品各檢出峰遷移時間與標準品電泳圖譜進行對比定性：竹蓀菌蓋、菌柄多糖主要由葡萄糖、甘露糖、半乳糖組成。由表2可知：在商品竹蓀加工過程中丟棄的菌蓋的多糖中葡萄糖含量分別是商品竹蓀的可食菌體部位（菌裙和菌柄）的3．7和1．1倍，甘露糖是其2．5和1．3倍，半乳糖是其3．5和2．2倍；而丟棄的菌托的多糖中單糖含量更是遠遠超過了菌裙和菌柄（除菌托中半乳糖與菌柄中含量相當外），具體含量差距為：葡萄糖含量是菌裙和菌柄的4．3和1．3倍，甘露糖是其4．9和2．6倍，半乳糖是其1．5和0．95倍。據此可對菌托、菌蓋進行綜合利用。

3結論

膠束毛細管電泳法對糖類物質分離檢測的方法，具有線性范圍寬、重現性好等特點，可用作竹蓀中多糖組成測定的常規方法。同時，通過對竹蓀菌子實體四個部位多糖水解液對比分析可知，作為竹蓀加工廢棄物的菌蓋多糖由葡萄糖、甘露糖、半乳糖組成，菌托多糖由葡萄糖、甘露糖、半乳糖、阿拉伯糖組成，兩種廢棄物多糖含量均超過竹蓀菌可食的菌裙和菌柄部分。

作者：白新偉 紅 陳定梅 田玲 單位：六盤水師范學院化學與化學工程系