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1毒性檢測方法

1.1急性毒性檢測

生物毒性檢測按毒性指標類別不同，可分為急性毒性檢測、慢性毒性檢測、遺傳毒性檢測和內分泌干擾性檢測。突發環境風險防范要求，對毒性物質釋放后果分析中以急性中毒為重點，因此，該文主要總結基于急性毒性的檢測與評價方法。急性毒性實驗是對實驗生物一次或24h內多次染毒的實驗，從中探明環境污染物與機體短時間接觸后所引起的損害作用，找出污染物的作用途徑、劑量與效應的關系。依據受試生物類型，可將生物急性毒性實驗分為活體動物實驗、大型蚤類實驗、細菌實驗和微生物發電實驗等。細菌實驗是目前毒性檢測中研究較為成熟、應用最為普遍的方法，例如發光細菌法、脫氫酶活性法等。中國標準規定的毒性檢測方法即是發光細菌法。然而，傳統生物監測方法存在檢測時間長、維護成本高、指示生物保存困難等問題，應對突發性水質污染現場監測、實現污染源在線監測等急需開發快速、簡便、靈敏、易維護的生物毒性檢測技術。基于微生物產電的MFC型(微生物燃料電池，能將化學能直接轉化成電能的裝置)生物毒性傳感器成為眾多學者關注的對象。它的工作原理是利用微生物胞外呼吸，將水體有機污染物生物氧化過程產生的電子直接傳遞至電極，通過回路形成電流=，當水體中毒物積累，會抑制微生物呼吸，造成電流信號減弱。傳感器能實現對分子、離子及氣體物質的快速感應和分析，是發展便攜式快速水質監測儀的關鍵，目前已成功研發了BOD快速測定儀，并由雙室向單室研究過渡，節省空間，降低成本。該方法運用多種產電菌與發酵型細菌組成混合菌群，避免了使用單一菌種提純難、易變異的缺點。美國的廢水急性毒性實驗主要包括毒性濃度范圍確定實驗、多濃度限定實驗和受納水實驗等。毒性濃度范圍確定實驗通常是由一組小型梯度靜態急性實驗構成，具體來說是將相同的五組生物分別暴露于按對數級稀釋的樣品溶液(例如按100%，10.0%，1.00%，0.100%和一個質控樣)8～24h。多濃度限定實驗，是美國污染物減排計劃要求的決定排放允許值的方法，用來提供半致死濃度值或最大無影響濃度值(NOEC)。實驗需設置至少5個梯度水樣和一個質控樣，美國環保局推薦使用稀釋因子a≥0.5來選擇水樣濃度，通常使用的是6.25%，12.5%，25%，50%和100%。受納水實驗則是用來判定待排放廢水(以下簡稱受納水)能否被環境接納，操作要求是在100%受納水與質控樣的總硬度和鹽度相當的情況下，用至少10種生物進行測定，若兩者結果差距較大，需重新對受納水進行分析控制。另外，上述實驗可按狀態分為靜態實驗和動態實驗，靜態實驗又分為水樣更新和不更新兩種。英國的Williams等對比了傳統的工業廢水理化分析實驗與廣被國際采納的急性毒性實驗的優劣，用發光細菌、魚和鹵蟲等生物進行驗證，得出發光細菌在急性毒性試驗的敏感性可與無脊椎動物和魚類相媲美，且操作更加方便快捷。黃正等分別應用細菌發光實驗及Ames實驗研究了武漢市易家墩、黃孝河污灌區工業廢水的急性毒性和致突變性，結果表明，廢水中急性毒性物質主要包括苯酚、苯甲酸、苯甲酯等，致突變致癌物包括聯苯、萘等。李麗君等利用斑馬魚對某市六家典型企業廢水進行急性毒性測試，以LC50為評價指標，初步得出廢水毒性強度排序。

1.2全廢水毒性測試法

全廢水毒性測試法由USEPA提出，2004年形成全廢水毒性執行導則，為美國NPDES提供技術支撐，此舉依據清潔水法案，旨在加強水質管理，控制有毒廢水排放，保護水生生物。全廢水毒性測試法是一種急性毒性測試法，它通過直接對水生生物實驗來檢測水樣(例如工業廢水)的綜合毒性效應。具體來說，是在實驗室里選擇特定的生物物種放入不同濃度的水樣中，在一個確定的時間內，觀測其生物效應(如生長率、存活率、繁殖率等)，用以評估水質。由于全廢水毒性測試針對的是水樣中所有化學物質的綜合危害效應，對于目前沒有形成標準的化學物質也能表征，克服了單一污染物指標監測的缺點，能夠很好的預防和避免有毒物質排放所造成的不利影響。Tonkes等運用全廢水毒性測試法對荷蘭6類工業、17種工業廢水進行評估。所有廢水都使用4種受試生物進行測試，結果顯示每種生物至少能檢出15種工業廢水毒性;而此前用單一污染物指標測試法對該17種廢水進行分析，有8種未能得出毒性數據。Naddy等用三種淡水藻類做指示生物進行未知毒性廢水的WET檢測，并用毒性鑒別評價法(詳見下文3.1)確認，得出該廢水由于正磷酸鹽過量而致毒。綜上所述，全廢水毒性測試法可有效檢測組分復雜的廢水中有毒有機污染物，鑒別出導致廢水生態毒性的關鍵有機毒物，是毒物污染點源控制和生態風險管理的重要手段。但在具體操作中，并不是完全以此法取代傳統的單一污染物指標測試法，全廢水生態毒性測試法適用于組分復雜的有毒工業廢水和城市綜合污水等，在應用傳統方法的同時采用此法，可取長補短，相得益彰。

2毒性評價標準

2.1效應終點生物毒性的危害閾值在國外或稱為效應終點值廢水毒性測試最常用的效應終點評價指標是生長率，繁殖率和存活率Prado等研究微藻類對除草劑的敏感性，通過評估不同的效應終點(生長率、細胞繁殖能力、代謝活動和DNA損傷情況)來比較敏感性的不同。Diz等進行微生物短期毒性實驗，用死亡率和繁殖率作為評價效應終點，得出用繁殖率評價效應更加靈敏。Khan等探索了新的效應終點指標———性成熟度，該指標只應用于慢性毒性測試中。

2.2評價指標

2.2.1效應閾值評價生物毒性的效應閾值主要包括半致死濃度、半抑制濃度(IC50)和最大無影響濃度(NOEC)。半致死濃度指動物急性毒性試驗中，使受試動物半數死亡的毒物濃度，它是衡量存在于水中的毒物對水生生物和存在于空氣中的毒物對哺乳動物乃至人類的毒性大小的重要參數。在比較各種污染物的毒性、不同種或不同發育階段的動物對污染物的敏感性以及環境因素對毒性影響等方面的研究中，多以LC50為依據。毒性物質的致死效應與受試動物種類、暴露途徑和暴露時間有密切關系，用LC50表示水中毒物對水生生物的急性毒性，應明確標注受體水生生物的種類和暴露時間，如鮭魚、鯉魚等的24、48和96h的LC50等。半抑制濃度指反應被抑制一半時抑制劑的濃度，這里的反應可以是酶催化反應，抗原抗體反應等。最大無影響濃度指在毒性試驗中毒性物質對受試生物的影響和對照相比無統計學差異的最大濃度。

2.2.2毒性單位在毒性鑒別評價中，毒性數據的表示方法采用毒性單位。TUs計算法由USEPA提出，全廢水的TU值是用全廢水值(即含原廢水濃度，按100%計)除以LC50、IC50或NOEC的所得值;確定化合物的TU值則是用化合物濃度除以化合物的效應水平。在受試物種和受試時間相同的情況下，采用毒性單位TU表示毒性大小，可以對廢水毒性進行比較。毒性單位也是制定廢水排放毒性標準的依據，美國廢水排放毒性基準常定為急性毒性＜0.3TU，慢性毒性＜1.0TU。

2.2.3潛在毒性效應指數潛在毒性效應指數是由加拿大環境中心的研究人員提出，曾被應用于“拯救圣勞倫斯河計劃”，作為識別重點污染源的一項關鍵指標。它綜合考慮了毒性的降解性/持續性、多重性/特異性和廢水排放量，是用于評估和比較工業廢水潛在毒性的新指標。該指標是用對數值(log10)表示的，范圍從0到正無窮，但通常結果不會超過10。PEEP值的數學計算見公式(1)，結構簡單、易于調節，可適用于特殊需要的生物測定類型。式中，PEEP為潛在毒性效應指數，無量綱;n為生物毒性(或遺傳毒性)測定指標呈陽性的個數，無量綱;N為生物毒性測定指標總數，無量綱;Q為排水流量，m3/a;TUi為第i個生物毒性測定的毒性單位;LC50為第i個生物毒性測定的半致死濃度。目前，PEEP還未被廣泛應用。孫曉怡等用蠶豆微核試驗、發光細菌急性毒性試驗、魚類急性毒性試驗逐一單項分析評價了撫順市10家典型企業11個排水口廢水的生物毒性，并計算各企業廢水PEEP值評估毒性等級。結果顯示，10家企業的PEEP均大于6，需進行毒性削減控制。

3毒性評價方法

在明確了毒性檢測方法和毒性評價標準的基礎上，結合相關儀器進行精密分析，系統地總結監測技術過程，并將其運用到工業廢水實例，經過驗證得出了工業廢水毒性評價方法，目前發展較成熟的有美國毒性鑒別評價法和歐盟效應導向分析法。

3.1毒性鑒別評價法

3.1.1方法來源毒性鑒別評價法是美國于1994年完成的，最初用于工業廢水的監測，后經發展也適用于河流、湖泊、孔隙水、固體廢棄物浸出液的毒性鑒別。其目的是快速、簡便地鑒別引起毒性的化學物質，現已被多個國家或地區參考采納。該方法運用WET得到廢水綜合毒性，再選擇合適的分析方法對化學物質進行毒性識別，從廢水的多種污染物中篩選出需要優先控制的有毒化學物質。

3.1.2方法流程TIE分為三個階段:第一階段，表征致毒成分的物理化學性質;這些理化性質是不需要特別鑒定就可獲得的，包括溶解性、揮發性、可濾性等。第一階段是后續鑒別的基礎，也為確定去除毒性的方法提供數據支持。由于在整個TIE中都是運用水生生物的急性致死實驗，不同動物測出的結果是不同的，因此選擇何種受試動物是關鍵之一，在TIE中推薦使用水蚤類動物作為受試物種。第二階段，對初步確認的毒性物質(以下稱可疑毒物)進行分離鑒定。目前，USEPA已明確給出鑒別方法的只有非極性有機化合物、氨、金屬、氯和表面活性劑，比如采用色譜質譜聯用法鑒別多數非極性有機化合物，而針對更廣泛的有毒物質鑒定方法還需進一步探討。第三階段，進一步確認可疑毒物，即驗證階段一和階段二的識別方法是否可行。采用的方法主要有相關分析法、癥狀分析法、物種敏感度法、同位素示蹤法、質量平衡法和水質調整法等。為確保結論的準確性，完成階段三須在限定的日期內，因為階段一和二旨在鑒定物質的急性毒性，時間過長可能表現出物質的慢性毒性效應而引發不良后果。但這不代表TIE不能進行慢性毒性評估，而是還需要進一步探究。

3.1.3方法應用TIE不僅應用于工業廢水監測，也可應用于其他水樣的毒性鑒別，例如周圍水環境、沉積物間隙水、固體廢物浸出液等。毒性數據的表示方法采用毒性單位TUs。HongjunJin等對南京一家化工廠的廢水進行毒性鑒定，詳細闡述了毒性鑒別評估的流程。使用水蚤作指示生物，在階段一中初步確定有毒成分為非極性有機化合物;第二階段，使用C18固相抽提和分離技術獲得有毒物質，然后采用GC-MS濃縮分析出苯并芘和苯酚含量超標而致毒;在第三階段的苯并芘/苯酚混合實驗和質量平衡試驗中，驗證得出此兩種物質為關鍵有毒物質。美國學者Mount對一種異常工業廢水進行毒性鑒別評估，找出致毒物質和原因。首先使用模糊網紋蚤作指示生物，顯示其急性毒性十分強烈。階段一的毒性表征實驗未對樣品毒性進行去除，繼續對樣品進行活性碳、陽離子交換、陰離子交換和陰陽離子混合交換處理，發現，經前兩者處理的樣品急性毒性未降低，而經后兩者處理的樣品急性毒性全部去除，由此推斷，致毒物質可能是無機陰離子。后經化學分析檢測出大量致毒物質六價鉻，即被確認為引起急性毒性的關鍵物質。此外，TIE方法現也發展用于沉積物毒性鑒別評估。

3.2效應導向分析

3.2.1方法來源據統計，每年有幾百萬kg的生物毒性物質被釋放到環境，這些物質構成了復雜混合體存在于廢水、廢液和廢渣中。盡管目標化學分析即前文提到的單一污染物指標分析法，足以檢測到痕量化學物質，但它不能識別出廢水樣本中所有的化學物質。因此，將CTA應用于風險評估與管理，可能忽略未知的或不可預見的毒物的危害。自1980年，國外有學者開始探討將分餾化學分析技術與生物毒性檢測相結合，系統地移除廢水樣本的無毒成分，降低廢水樣本的復雜性，從而準確地鑒定出有毒物質。該方法被稱為效應導向分析，它是預測識別未知毒物和建立原因-效果關系的強大工具。

3.2.2方法流程EDA通過生物效應分析來評估毒性、采用逐步分餾技術降低樣本復雜性直到毒性成分被簡化到能夠進行詳細的化學分析，其流程見圖1EDA里的生物效應分析多采用細菌實驗，另外也有基因突變實驗、染色體實驗、DNA損傷實驗和活體動物實驗;抽提與分餾技術主要包括C18固相萃取法，C18反相色譜柱和高效液相色譜法;然后采用GC-MS或其他光譜法測定活性分子物質，而對于較難分析的極性物質用LC-MS方法測定。在整個EDA分析中，生物實驗與化學分析交替運用，逐步分離各類物質進行鑒定，最終確認毒性物質。

3.2.3方法應用EDA可用于分離和識別對特定生物體有嚴重毒害作用的復雜樣本(例如污水、沉積物、廢液等)中的化合物。Grung等對克羅地亞Zagreb市的污水進行效應導向分析。該污水集中了生活污水和工業廢水，成分相當復雜。首先，利用虹鱒魚原肝細胞進行生物實驗，測定脫乙基酶活性、雌激素活性和細胞毒性;然后分別采用固相萃取法和高效液相色譜法提取獲得廢水毒性成分;再結合化學物質分析技術測定毒性物質，針對影響雌激素的毒性物質，用LC-MS分析出類固醇和雌三醇，用GC-MS分析出烷基酚、苯甲酮、對羥基苯甲酸甲酯。還有一部分毒性貢獻物質暫時未能確定其名稱，但可以計算其毒性效應，為實現風險評估和危險物質監測提供數據。Kaisarevic等應用EDA對塞爾維亞Pancevo工業地區的污水管道沉積物進行分析。以H4IIE型鼠肝細胞株作指示進行生物毒性實驗，采用多級正相HPLC分餾提取出18種物質，包括PCBs、PCDDs、PAHs和一些極性化合物。再重復進行細胞實驗，得出PAHs的毒性貢獻最大，后經化學分析法測得PAHs的濃度值。

4結語

工業廢水生物毒性檢測技術經歷了從活體動物實驗、大型蚤類實驗、細菌實驗到基于微生物產電的毒性檢測技術，是研究人員在力求檢測準確性的前提下，不斷探索更加便捷高效方法的過程。廢水毒性的監測與管理要求操作簡單、快速靈敏、便于維護，最好可以在現場進行實地檢測和連續檢測，因此，微生物產電毒性檢測技術具有相當好的發展前景。然而，該方法在確定毒性劑量與微生物產電能力的關系、建立評價標準、實現技術與應用結合、開發毒性快速檢測儀器等方面還需要進一步探索。美國等發達國家已建立了大量的生物毒性檢測技術標準和指南，且獲得成功實施與應用。中國目前監控工業廢水有毒物質排放仍以傳統單一污染物的理化監測為主要手段，已明確要求進行急性毒性測試并列入排放標準的工業行業只有制藥工業(包括發酵類、化學合成類、提取類、中藥類、生物工程類和混裝制劑類)，規定其測定方法為發光細菌法。隨著中國“十二五”規劃對環保要求的提高和相關法規的建立與完善，在控制工業廢水中污染物濃度基礎上，加強對廢水的綜合毒性控制，借鑒國外先進的毒性檢測和評估方法，建立健全中國工業廢水毒性控制技術規范，以更好地保障水質安全、保護水生生態系統，已經勢在必行。

作者：梁慧袁鵬宋永會程建光趙亞麗單位：山東科技大學，化學與環境工程學院中國環境科學研究院城市水環境科技創新基地