本站小編為你精心準(zhǔn)備了風(fēng)疹病毒多表位診斷抗原的制備參考范文，愿這些范文能點燃您思維的火花，激發(fā)您的寫作靈感。歡迎深入閱讀并收藏。

《病毒學(xué)報》2016年第三期

摘要：

原核表達(dá)與層析純化獲取風(fēng)疹病毒多表位診斷抗原，并初步評價其抗原性。將RV衣殼蛋白Caa3～29、aa96～123以及包膜糖蛋白E1aa208～247三個主要免疫顯性表位串聯(lián)，密碼子優(yōu)化后全基因合成；利用基因重組技術(shù)將多表位串聯(lián)片段插入帶有GST標(biāo)簽的表達(dá)質(zhì)粒中，在大腸桿菌中進(jìn)行表達(dá)，并利用親和層析和離子交換層析純化目的蛋白；利用WesternBlot（WB）技術(shù)對目的蛋白抗原性進(jìn)行鑒定，并建立RV－IgM抗體檢測ELISA技術(shù)，初步評價此方法對陰陽血清樣本的鑒別能力。獲取高度均質(zhì)的RV多表位診斷抗原，WB實驗表明目的蛋白不但可以被anti－GST單克隆抗體識別，還可以被anti－RV多克隆抗體、RV－IgM陽性血清相應(yīng)抗體所識別。分別對48份RV急性感染病例的陽性血清、陰性血清和健康人血清進(jìn)行檢測，發(fā)現(xiàn)一致性優(yōu)異。原核表達(dá)與層析純化可以獲取抗原性良好的RV多表位診斷抗原，偶聯(lián)HRP后可以作為檢測抗原應(yīng)用于RV－IgMELISA血清學(xué)檢測中。

關(guān)鍵詞：

多表位抗原；風(fēng)疹病毒；原核表達(dá)；層析純化；GST標(biāo)簽

風(fēng)疹病毒（是風(fēng)疹的病原體，屬于披膜病毒科風(fēng)疹病毒屬，為有包膜正義單鏈RNA病毒，人是唯一宿主。RV只有一個血清型，但有多個基因型，目前共有12個被認(rèn)可的基因型（1B，1C，1D，1E，1F，1G，1H，1I，1J，2A，2B，2C）和一個臨時基因型（1a）正在或曾在世界各地流行［1］。近年來我國RV的流行是由1E和2B基因型共循環(huán)引起的多個傳播鏈所致，其中1E基因型為優(yōu)勢型別［2］。RV感染成人一般為自限性疾病，但是孕婦感染，尤其是妊娠前三個月的新發(fā)感染將會引發(fā)流產(chǎn)、死產(chǎn)或胎兒感染后先天性風(fēng)疹綜合征［3］。鑒于RV的新近感染或急性感染診斷對預(yù)防新生兒風(fēng)疹意義重大，我國已經(jīng)將RV感染檢測作為孕期檢測的一項重要內(nèi)容。臨床上通過檢測孕婦血清RV－IgM抗體以確定新近感染或急性感染，但目前國內(nèi)檢測人血清RV－IgM抗體診斷試劑盒參次不齊，需要進(jìn)一步優(yōu)化。一般來說，新發(fā)RV感染的血清學(xué)診斷依賴于RV－IgM抗體的檢測或者恢復(fù)期病人血清IgG抗體水平四倍升高。RV感染的體液免疫應(yīng)答始于低親和力IgM抗體的產(chǎn)生，隨后抗體類型轉(zhuǎn)換導(dǎo)致親和力高、免疫效應(yīng)強的抗體型別產(chǎn)生而消除入侵的病原體。其中補體決定區(qū)的體細(xì)胞超突變將導(dǎo)致親和力逐漸增強的抗體產(chǎn)生。抗體親和力檢測也常被用于新發(fā)感染與過往感染的區(qū)分，但尿素等解離劑打開不同親和力抗體與抗原的結(jié)合程度無法準(zhǔn)確把握。因此RV－IgM抗體的檢測結(jié)果作為臨床輔助診斷相對比較客觀。RV三個結(jié)構(gòu)蛋白（衣殼蛋白C、兩個跨膜糖蛋白E1和E2）均可引發(fā)抗體應(yīng)答，但只有E1蛋白為免疫顯性的［4］。免疫沉淀和免疫印跡技術(shù)也證實大部分抗RV抗體應(yīng)答主要由E1蛋白誘發(fā)，而且血凝素活性和病毒中和活性都?xì)w于E1蛋白的aa208～239，aa213～239，aa214～240［5］。E1aa208～239已被證實是病毒的主要中和表位［6］，并且作為一種多肽診斷抗原構(gòu)建的ELISA檢測方法可以與傳統(tǒng)RV檢測ELISA、血凝素凝集實驗以及病毒中和滴定法相媲美［7］。而且這個表位在不同RV株之間是保守的，已被推薦用來測定保護(hù)性免疫ELISA檢測指標(biāo)［7，8］，因此RV診斷抗原中必須包含這個表位。同時E2和衣殼蛋白C也同樣能引發(fā)機體免疫應(yīng)答，已經(jīng)鑒定出E2糖蛋白上一個B細(xì)胞表位aa31～105，衣殼蛋白C上兩個B細(xì)胞表位aa1～30和aa96～123［9］。考慮到衣殼蛋白C在病毒顆粒中的含量以及在病毒生命周期中的重要作用，我們在構(gòu)建表位依賴性診斷抗原時也同時加入衣殼蛋白C上的兩個B細(xì)胞表位。谷胱甘肽S－轉(zhuǎn)移酶基因融合表達(dá)系統(tǒng)具有蛋白表達(dá)、純化和檢測多種用途。氨基端融合日本血吸蟲GST的蛋白很早就被證實可以在大腸桿菌（E．coli）中可溶性、高水平的表達(dá)［10］。GST自身在E．coli中表達(dá)可以自發(fā)折疊成具有天然構(gòu)象的具有酶活性的26kDa蛋白質(zhì)。擁有GST的全部氨基酸序列的融合蛋白也被證實具有GST酶活性［11］。而且細(xì)菌裂解物中的GST融合蛋白利用Glutathione親和層析介質(zhì)很容易純化。本實驗中我們將RV多表位抗原插入到GST表達(dá)載體中，使其可以表達(dá)出GST－RV融合蛋白，一是避免過多的酶偶聯(lián)到抗原表位上產(chǎn)生空間位阻效應(yīng)而將抗原位點封閉，二是使融合蛋白可以在E．coli中高效可溶性表達(dá)。同時在融合蛋白的羧基端我們添加了His標(biāo)簽，可以利用更加便宜的親和介質(zhì)進(jìn)行目的蛋白的純化，大大降低了蛋白純化的成本。本研究利用原核表達(dá)系統(tǒng)和層析純化技術(shù)獲取的RV串聯(lián)表位診斷抗原建立RV－IgM抗體捕獲法ELISA，來鑒定RV的新近感染或急性感染。

一、材料與方法

1主要材料與試劑E．coliBL21（DE3）和GST載體為科室現(xiàn)存，限制性內(nèi)切酶NcoI和XhoI以及T4DNA連接酶購自日本TaKaRa公司。

2基因合成根據(jù)大腸桿菌密碼子偏好表，對多表位串聯(lián)片段基因序列進(jìn)行優(yōu)化（圖1），并在其5’端引入NcoI酶切位點，3’端引入XhoI酶切位點，交由大連寶生物公司合成，基因片段大小為314bp，命名為H29F。

3表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建基因片段H29F人工合成后存于pMD－19T載體上，用限制性內(nèi)切酶NcoI和XhoI將目的片段酶切下來，連接到相同酶切處理的GST表達(dá)載體（本科室構(gòu)建，圖1）上，轉(zhuǎn)化E．coliBL21（DE3）感受態(tài)細(xì)胞。次日挑取單克隆菌落進(jìn)行培養(yǎng)與小量表達(dá)，提取陽性克隆質(zhì)粒進(jìn)行測序和雙酶切鑒定。鑒定正確的質(zhì)粒命名為H29。4目的蛋白的表達(dá)和純化將新鮮轉(zhuǎn)化H29質(zhì)粒的E．coliBL21（DE3）接種于含氨芐霉素（50μg／mL）的LB培養(yǎng)基（10g／L蛋白胨，5g／L酵母提取液，10g／LNaCl）中，32℃振蕩培養(yǎng)16h后等倍擴菌。37℃繼續(xù)培養(yǎng)2h后將溫度調(diào)至35℃，IPTG終濃度1mmol／L誘導(dǎo)4h后離心收菌（3000g，10min，4℃）。用溶液I（10mmol／LTris–HCl，0．5％TritonX－100，pH8．0）重懸菌體沉淀后超聲破碎（300w－20s－20s－30次），離心（174000g，10min，4℃）收集上清。上清中加入終濃度為500mmol／L的NaCl后上樣于用溶液II（10mmol／LTris–HCl，500mmol／LNaCl，pH8．0）平衡的ChelatingSepharoseFastFlow層析介質(zhì)中。待上樣完畢，用0mmol／L，30mmol／L，60mmol／L，300mmol／L咪唑（溶于溶液II中）進(jìn)行梯度洗脫，并收集相應(yīng)洗脫液。分別取樣SDS－PAGE電泳觀察目的蛋白的含量以及分布情況，將目的蛋白含量最高，純度最好的洗脫液于基液III（10mmol／LTris–HCl，pH8．0）中進(jìn)行徹底透析備用。DEAESeph－aroseFastFlow層析介質(zhì)用基液II平衡后將透析液上樣，待上樣完畢，用0mmol／L，100mmol／L，200mmol／L，400mmol／LNaCl（溶于基液III中）進(jìn)行梯度洗脫并收集相應(yīng)洗脫液。分別取樣SDS－PAGE電泳觀察目的蛋白的含量以及分布情況。將目的蛋白含量最高，純度最好的洗脫液于PBS（137mMNaCl，2．7mMKCl，10mM的Na2HPO4，2mMKH2PO4，pH7．4）中徹底透析后，于4℃保存?zhèn)溆谩?目的蛋白的鑒定利用WesternBlotting技術(shù)對H29抗原性進(jìn)行鑒定。10μlH29蛋白溶液以及10μlGST標(biāo)簽蛋白溶液（本實驗室預(yù)制）上樣13．5％SDS－PAGE進(jìn)行電泳（恒流40mA，50min），而后半干轉(zhuǎn)膜至硝酸纖維素膜（NC）（恒壓15V，30min）上。轉(zhuǎn)膜完成后，NC膜用封閉液（含5％脫脂奶粉的PBST）于4℃處理過夜。次日分別加入封閉液稀釋的Goatanti－Rubellapolyclonalantibody（12000；MerckMillipore）、Mouseanti－GSTmonoclonalantibody（12000；MerckMilli－pore）、RV－IgM陽性血清（120）、RV－IgM陰性血清（120），常溫孵育1h后用PBST洗膜5次。檢•250•病毒學(xué)報32卷測抗體對應(yīng)為Rabbitanti－GoatIgG－HRPconju－gate（14000；MerckMillipore）、Goatanti－MouseIgG－HRPconjugate（14000；MerckMillipore）和Goatanti－h(huán)umanIgM－HRPconjugate（14000；MerckMillipore），常溫孵育1h后PBST洗膜5次，最后DAB顯色，清水終止顯色。6H29－HRP偶聯(lián)反應(yīng)IgM抗體捕獲法ELISA構(gòu)建中，檢測抗原被設(shè)計為H29－HRP偶聯(lián)物。H29－HRP偶聯(lián)反應(yīng)按照試劑盒操作步驟操作（KPL，MD，USA）。簡言之，純化的H29去內(nèi)毒素處理后，在HRPconjugationbuffer中透析，透析完成后將終濃度調(diào)整為2．0mg／ml。然后逐滴加入合適體積的SureLINKTMActivatedHRP（HRPH29≈2．51）。緩慢攪拌下，4℃孵育過夜。向溶液中加入10μlReducingAgent（NaCNBH3），室溫孵育15min終止反應(yīng)。最后加等體積2×HRPStorageBuffer，室溫孵育15min后，4℃保存?zhèn)溆谩＠闷灞P法滴定anti－GSTmonoclonalanti－body和H29－HRP評價偶聯(lián)反應(yīng)效率。用碳酸鹽包被緩沖液二倍系列稀釋Mouseanti－GSTmono－clonalantibody（1250～116000），每個微孔板中加入100μl后，37℃孵育2h。用PBS洗滌3次后，每孔加入200μl封閉液封閉包被孔中的非特異蛋白結(jié)合位點。37℃孵育1h后，PBS洗滌3次。然后，用PBS二倍系列稀釋H29－HRP（1250～116000），每孔加入100μl后，37℃孵育1h。PBS洗滌5次后每孔加入50μlTMB（MP，CA，USA）孵育10min。最后加入50μlH2SO4（1mol／L）終止反應(yīng)。參考基線波長為620nm，用酶標(biāo)儀測定450nm波長吸收度值（OD值）。7目的蛋白診斷效能的評價利用H29－HRP建立血清RV－IgM抗體診斷ELISA試劑盒，并對臨床和實驗室確診的血清樣本進(jìn)行檢測，評價試劑盒對陰陽性血清標(biāo)本的鑒別能力。簡言之，碳酸鹽包被緩沖液稀釋抗μ－二抗（1500）后包被板條孔，封閉液封閉非特異性位點；加入待測血清（1：10稀釋），置37℃孵育1h，然后洗滌；加入H29－HRP偶聯(lián)物（11000稀釋），置37℃孵育1h，然后洗滌；加入TMB顯色，參考基線波長為620nm，用酶標(biāo)儀測定波長為450nm吸收度值（OD值）。

二、結(jié)果

1目的蛋白的構(gòu)建與表達(dá)純化H29的構(gòu)建如圖1，融合蛋白的氨基端為GST標(biāo)簽，緊跟著衣殼蛋白兩個抗原表位（aa3～29和aa96～123），然后是E1aa208～247抗原表位，羧基端為His標(biāo)簽，間隔中添加了必要的連接臂（如GGGS等）以及合適的酶切位點（如NdeI、NcoI和XhoI）。雙酶切處理（NcoI和XhoI）GST表達(dá)載體和H29F－pMD－19T獲取帶有相同粘性末端的載體（大約6170bp；圖2A）和H29片段（約314bp；圖2B），經(jīng)過連接酶連接轉(zhuǎn)化入E．coliBL21（DE3）感受態(tài)細(xì)胞后進(jìn)行培養(yǎng)，測序、小量表達(dá)（圖3A）和雙酶切鑒定結(jié)果（圖2C）證實目的片段已經(jīng)成功插入表達(dá)質(zhì)粒中，并將正確質(zhì)粒命名為H29質(zhì)粒。挑取6個新鮮轉(zhuǎn)化H29質(zhì)粒的E．coliBL21（DE3）單克隆菌落培養(yǎng)適當(dāng)時間后進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)，SDS－PAGE電泳結(jié)構(gòu)發(fā)現(xiàn)，與對照組相比，在約37kDa處有明顯表達(dá)條帶（圖3A），表明H29蛋白可以在大腸桿菌中有效表達(dá)。大量表達(dá)后發(fā)現(xiàn)目的蛋白主要存在于超聲菌體沉淀重懸液的上清中（圖3B），目的蛋白含量達(dá)到34．17％。將上清液進(jìn)行處理后利用His親和層析進(jìn)行純化，電泳結(jié)果發(fā)現(xiàn)，目的蛋白主要存在于300mmol／L咪唑洗脫液中（圖3B），并且目的蛋白含量達(dá)到了92．21％，濃度為2．2mg／mL。300mmol／L咪唑洗脫液經(jīng)過完全透析后，上DEAE陰離子交換層析柱，電泳結(jié)果發(fā)現(xiàn)目的蛋白主要分布于200mmol／LNaCl洗脫液中，并且目的蛋白的含量達(dá)到了94．86％，濃度為2．1mg／mL（圖3B）。最后將200mmol／LNaCl洗脫液在PBS中進(jìn)行透析，4℃保存?zhèn)溆谩?目的蛋白的鑒定根據(jù)目的蛋白中包含GST、RV表位等特征，對H29蛋白的抗原性進(jìn)行初步鑒定。WesternBlot結(jié)果顯示，利用羊抗RV多克隆抗體、鼠抗GST標(biāo)簽抗體以及RV－IgM陽性血清作為捕獲抗體，其相應(yīng)二抗作為檢測抗體，在NC膜上相應(yīng)位置都出現(xiàn)了明顯條帶（圖4）；并且RV－IgM陰性血清作為捕獲抗體，在NC膜上相應(yīng)位置沒有出現(xiàn)對應(yīng)條帶。表明了H29蛋白包含了RV抗原表位和GST標(biāo)簽。3目的蛋白診斷效能的評價通過棋盤滴定法確定H29－HRP最適工作濃度為11000，并且表明H29和HRP已經(jīng)成功偶聯(lián)，可以應(yīng)用于RV－IGM抗體檢測ELISA試劑盒的建立。利用H29－HRP偶聯(lián)蛋白作為診斷抗原建立RV－IgM抗體檢測ELISA試劑盒，分別對48份陽性血清、陰性血清和健康人群血清樣本進(jìn)行檢測（表1）。從圖5可得出，陽性血清樣本、陰性血清樣本以及健康人群血清樣本A值分布范圍分別為1．60（1．21～1．76，95％置信區(qū)間）、0．34（0．25～0．49）和0．23（0．17～0．37）。以陰性結(jié)果平均數(shù)的2．1倍粗略估算ELISA試劑盒的cutoff值為0．5985，得出其靈敏度為95．84％，特異性為91．67％。并且陽性血清樣本與陰性血清樣本和健康人群血清樣本A值分布明顯不同（P＜0．05），而陰性血清樣本與健康人群血清樣本A值分布無明顯區(qū)別（P＞0．05）。對表1數(shù)據(jù)進(jìn)行卡方檢驗，我們發(fā)現(xiàn)，其χ2＝2．5，P＝0．1138＞0．05，說明ELISA診斷結(jié)果與臨床和實驗室確診結(jié)果之間無統(tǒng)計學(xué)意義。而且kappa值為0．8485，表明一致性優(yōu)越。因此，新型RV－IgM抗體診斷試劑盒可以很好地鑒別陰陽性血清樣本。

三、討論

本研究中，我們選擇了RVE1蛋白上已經(jīng)被用圖5H29抗原診斷效果評價Figure5EvaluationofthediagnosticeffectofH29protein于ELISA檢測的一個重要顯性表位aa208～247，而且添加了衣殼蛋白C的兩個表位aa3～29和aa96～123作為診斷抗原，其目的是提高診斷試劑的靈敏度。雖然與包膜蛋白E相比，在誘發(fā)免疫應(yīng)答產(chǎn)生中和活性方面C蛋白抗原表位處于次要地位，但對于診斷而言C抗原意義也很重要［8，12］。在PeleD等研究中［8］，衣殼蛋白C多肽抗原與RV陽性血清反應(yīng)的滴度都在11600以上，表明RV陽性血清中存在大量與C蛋白上抗原決定簇可以發(fā)生反應(yīng)的抗體（已排除非特異結(jié)合反應(yīng)的存在），并且通過動物實驗證實C抗原也具有較高的免疫原性，可以誘發(fā)強烈的抗體應(yīng)答。針對目前市場上主要以E蛋白作為診斷抗原的試劑盒出現(xiàn)不同程度漏檢的現(xiàn)象，本研究添加C蛋白上的特異表位，旨在初步探索提高診斷試劑靈敏度的方案。GST作為融合蛋白前綴有效提高H29蛋白在原核表達(dá)系統(tǒng)中表達(dá)量的同時，也在一定程度上增強了其可溶性表達(dá)（圖3B）。WesternBlotting實驗證實了H29攜帶RV病毒的主要免疫顯性表位，并且可以與RV－IgM陽性血清中的相應(yīng)抗體發(fā)生反應(yīng)，初步證實了其抗原性可以應(yīng)用于新近感染或急性感染的診斷。另外我們將H29與HRP進(jìn)行了偶聯(lián)，并通過棋盤滴定法評價了偶聯(lián)效果以及確定了H29－HRP的最適工作滴度，為成品試劑盒的研發(fā)鑒定了基礎(chǔ)。此方法不但通過添加GST前綴有效避免了HRP偶聯(lián)帶來的抗原效價降低或失活，還將衣殼蛋白C的兩個B細(xì)胞表位納入診斷抗原分子中，同時提高了檢測方法的靈敏度和特異性。雖然H29與HRP偶聯(lián)實驗的重復(fù)性優(yōu)異，但是是過GST吸引HRP偶聯(lián)還是其他原因避免或者減少診斷抗原表位發(fā)生偶聯(lián)還待進(jìn)一步研究。另外，本研究中診斷抗原中保留GST和His標(biāo)簽，一是為了偶聯(lián)反應(yīng)中減少對RV表位的偶聯(lián)反應(yīng)，二是為了穩(wěn)定串聯(lián)表位在GST表面的有效展示，至于兩個標(biāo)簽對診斷抗原特異性的影響還需要進(jìn)一步的研究，據(jù)目前許多診斷抗原的研究中大多也攜帶著標(biāo)簽。并且新建立的IgM診斷試劑是以捕獲法ELISA作為基礎(chǔ)研制，已經(jīng)將標(biāo)簽的影響降低到了最低。我們利用本實驗室保存的臨床和實驗室診斷確定的陰陽性血清作為血清盤進(jìn)行抗原診斷能力的評價，尚未按照商品化血清學(xué)診斷試劑研發(fā)的要求，采用檢定所或其他權(quán)威機構(gòu)建立并提供的系列血清，并就檢測特異性及敏感度與國際上的商品試劑作比較。本研究旨在新型診斷抗原的構(gòu)建制備、抗原性研究以及其診斷能力的初步探索，實驗將進(jìn)一步拓展。總之，我們篩選出RV結(jié)構(gòu)蛋白上的抗原表位，并將其串聯(lián)在GST標(biāo)簽的羧基端，讓其在原核表達(dá)細(xì)胞中進(jìn)行表達(dá)，利用親和層析和離子交換層析成功獲取了帶有GST前綴蛋白和His后綴標(biāo)簽的診斷抗原，并將其應(yīng)用于風(fēng)疹病毒新近感染和急性感染的診斷，證實了H29診斷抗原在ELISA檢測技術(shù)中的實用性，很好地解決了RV抗原在偶聯(lián)HRP過程中造成的抗原失活或抗原效價降低，有效提高了檢測試劑盒的靈敏度和特異性。

作者：蘇秋東 郭敏卓 邱豐 賈志遠(yuǎn) 盧學(xué)新 孟慶玲 田瑞光 畢勝利 伊瑤 單位：中國疾病預(yù)防控制中心 病毒病預(yù)防控制所 北京出入境檢驗檢疫技術(shù)中心