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《病毒學報》2016年第三期

摘要：

建立中東呼吸系統綜合征冠狀病毒（MERS－CoV）感染的篩查與診斷應用的核酸檢測方法。本研究建立了基于MERS－CoV三個分子靶標（upE，ORF1b，N2）的雙重以及三重的三種熒光定量RT－PCR檢測技術方法，分別與前期建立的單重熒光定量RT－PCR（upE或N2）檢測方法做了比較，并且采用MERS－CoV病毒毒株、上海提供的口岸發燒病人樣本以及由首例中國MERS－CoV韓國地區輸入病例的咽拭子樣品和全血的樣品做了臨床驗證。結果顯示：采用MERS－CoV病毒毒株作為模板，三種新建立的多重檢測方法與單重熒光定量RT－PCR檢測方法最低檢測限均能達到10PFU／mL，且與其他常見呼吸道病毒的陽性樣本均無交叉反應，特異性良好。對臨床樣品的驗證中，上海病人咽拭子樣本均為陰性，而中國首例MERS輸入病例的急性期咽拭子樣品均為陽性，而全血樣的檢測結果顯示N2靶標有較高檢出率，明顯優于基于upE單一靶標。本研究所建立的基于MERS－CoV三個分子靶標的雙重以及三重熒光定量RT－PCR檢測技術方法用于MERS－CoV感染的實驗室診斷，具有較高靈敏度與特異性及適用性。

關鍵詞：

中東呼吸系統綜合征；冠狀病毒；熒光定量RT－PCR；多重；檢測

中東呼吸綜合征是由中東呼吸綜合征冠狀病毒感染所致的急性呼吸道傳染病，是繼嚴重急性呼吸綜合征冠狀病毒后的一種新發現的感染力強、病死率高、可在人群當中傳播的冠狀病毒，病毒溯源分析提示其可能來源于蝙蝠或中東沙漠地區的單峰駱駝［1，2］。MERS－CoV為有包膜的單股正鏈RNA病毒，基因組全長約30kb，該病毒基因組結構與其他已知的人類冠狀病毒相似，至少含有10個開放讀碼框架（openreadingframe，ORF），編碼病毒的多種結構蛋白和非結構蛋白［3］。與其他冠狀病毒所致的肺部感染相比，MERS－CoV感染的臨床表現沒有特征性差異，因此MERS－CoV確診病例的診斷需依據實驗室病原學檢測結果。MERS－CoV的實驗室檢測包括病毒核酸檢測、抗原抗體檢測及病毒分離鑒定［4－6］。其中，核酸檢測方法中的熒光定量RT－PCR方法具有時間短、靈敏度高、特異性好等優勢，是目前廣泛應用于MERS－CoV感染篩查與實驗室確診的工具［7］。各國科學家相繼建立了針對MERS－CoV多個靶標的單重熒光定量RT－PCR方法［8］，主要包括N基因，E蛋白上游、ORF1b及ORF1a。世界衛生組織于2014年9月頒布MERS－CoV實驗室診斷標準流程，認為ORF1b具有較好檢測特異性，但推薦以病毒E蛋白上游一段基因作為臨床樣品的初篩檢測靶標，兩個靶標同時陽性可確認MERS－CoV陽性。我們實驗室前期也已建立多種針對不同靶標的單重熒光定量RT－PCR方法［7］，通過對中國首例MERS－CoV輸入病例的檢測發現：N2的檢測靈敏度優于upE．為改進目前MERS－CoV核酸檢測方法，本研究基于upE，ORF1b，N2三個靶標，建立了三種雙重或三重MERS－CoV的熒光定量RT－PCR核酸檢測技術，采用從荷蘭伊拉莫斯醫學中心引進的MERS－CoV病毒毒株［9］、上海市出入境檢驗檢疫局提供的發熱病人樣品以及中國MERS輸入病例的咽拭子和全血樣品［7］做了臨床驗證。

一、材料與方法

1臨床樣品從荷蘭伊拉莫斯醫學中心引進MERS－CoV病毒毒株（hCoV－EMC）［3，9］，進行病毒培養并將病毒培養物梯度稀釋于適當緩沖基質（中國疾病預防控制中心病毒病預防控制所以統一使用的VTM病毒轉運培養基）中，得到不同濃度的MERS－CoV病毒培養物稀釋液，用于實驗方案的檢測下限的確定及靈敏度驗證。上海市出入境檢驗檢疫局送檢的20份口岸發熱人員咽拭子樣品，以及廣東省中國疾病預防控制中心病毒病預防控制所送檢的首例確診為輸入性MERS冠狀病毒病人的1份全血樣品和3份咽拭子樣品，均用于實驗室實驗方法的臨床驗證。病毒培養與送檢樣本經中國疾病預防控制中心BSL－3實驗室分裝滅活。感染其他常見呼吸道病毒并經實驗確定的發熱人員咽拭子樣品［10］（中國疾病預防控制中心病毒病預防控制所保存）用于檢測方法特異性的驗證。

2樣品核酸提取所有MERS－CoV病毒或臨床樣品首先經中國疾病預防控制中心病毒病預防控制所BSL－3實驗室病毒滅活，其他樣品在BSL－2實驗室滅活病毒。每個樣品均采用140μl進行病毒核酸提取，溶于60μl純水，得到核酸樣品提取液。

3方法設計

3．1引物及方案設計查閱文獻與基因序列比對，選擇基于upE，ORF1b，N2三個靶標建立雙重以及三重MERS－CoV的核酸檢測方案，引物設計及實驗方案見表1。

3．2熒光定量PCR檢測選取TaKaRa一步法熒光定量PCR試劑盒（OneStepPrimeScriptRT－PCRKit，寶生物），反應體系：2×RT－PCRbuffer12．5μl，TaKaRaExTagHS，引物（20μM）、探針（20μM）（參見表1），加水至20μl體系。分別加入樣品核酸提取液、陰性對照各5μl。于BioRedCFX96實時熒光定量PCR系統設置反應程序：42℃5min，95℃10s，95℃10s，60℃45s，共40個循環，在60℃檢測熒光。

3．3檢出下限及靈敏度驗證MERS－CoV病毒培養物進行滴度定量，然后滅活病毒培養物并進行倍比稀釋，提取倍比稀釋的病毒核酸稀釋液樣品，用于對各實驗方案的檢測下限和靈敏度的確認。

3．4特異性驗證選取實驗室保存的常見呼吸道病毒核酸陽性的臨床咽拭子樣品［10］，對各實驗方案的特異性進行驗證，陽性樣品包括有：HCoV－NL63，HCoV－229E，HCoV－OC43，HCoV－HKU1，流感病毒A／B型，人鼻病毒，呼吸道合胞病毒，副流感1、2、3、4型，腺病毒，人偏肺病毒，人博卡病毒。

3．5多重檢測體系比較依據方案設計（表1），進行雙重和三重熒光定量RT－PCR實驗方法的確立，并分別與相對應的單重熒光定量RT－PCR方法進行比較驗證。3．6臨床樣品驗證采用上海市出入境檢驗檢疫局送檢的20份口岸發熱人員咽拭子樣品，以及廣東省疾病預防控制中心送檢的首例確診為輸入性MERS冠狀病毒病人的1份全血樣品和3份咽拭子樣品進行實驗室實驗方案的臨床驗證。

 二、結果

1檢出下限確定以6個倍比稀釋的核酸稀釋液樣品為模板，每個梯度重復3次實驗，優化多重體系后，方案一、方案二、方案三均能達到最低檢測限為10PFU／ml，且不同檢測批次具有較好的重復性，見表2。

2特異性分析針對upE／ORF1b／N2三個靶標的擴增曲線見圖1。以其他常見呼吸道病毒陽性的臨床樣品核酸為模板，分別進行雙重和三重熒光定量RT－PCR反應，結果分析后均無MERS－CoV核酸擴增信號，無交叉反應，特異性良好。3臨床樣品檢測驗證采用上海出入境檢驗檢疫局送檢的20份口岸發熱人員咽拭子樣品，以及廣東省疾控中心送檢的首例確診為輸入性MERS冠狀病毒病人的3份咽拭子樣品進行MERS冠狀病毒檢測方案進行驗證，結果表明針對upE／ORF1b和upE／N2雙靶標雙色檢測方法及upE／ORF1b／N2三靶標檢測方法結果與前期建立的單重熒光定量RT－PCR（N2／ORF1b／upE）檢測結果一致，顯示檢測結果見表3，三種實驗方案均有良好的特異性擴增動力學特點，見圖1。Ct值N2靶標＜upE靶標＜ORF1b靶標（表3）。1份輸入性MERS冠狀病毒病人的全血樣品的檢測結果表明：只有含N2靶標的單重或多重熒光定量RT－PCR才能檢出陽性。故三種MERS冠狀病毒檢測方案均可應用于MERS冠狀病毒核酸檢測，且含N2靶標的檢測方案具有最好檢測靈敏度，適合于初篩。

三、討論

MERS－CoV于2012年9月在沙特阿拉伯首次被發現后，該病毒引起的MERS病例已出現在全球26個國家，主要分布在中東地區的阿拉伯半島國家，非洲、歐洲、亞洲和美洲的一些國家也報告了一些旅行相關病例，2015年5月韓國一名確診MERS－CoV感染患者輸入中國，我國對其進行了準確及時的檢測和監控，有效的控制了疾病的擴大和傳播［7］。因此在對新發傳染病進行診斷控制的同時，需要實驗室提供快速有效的實驗室病原學檢測結果。多個研究和我們的實驗結果表明：冠狀病毒N基因靶標為最敏感檢測靶標，我們的實驗結果也表明：upE和ORF1b區靶標具有相近的靈敏度，但upE的靈敏性要略優于ORF1b，二者均可用于MERS－CoV的篩查和確診實驗［4－8］。MERS－CoV核酸檢測中含N2靶標有較高檢出率，適合于初篩，尤其在臨床樣本應用上明顯優于基于upE單一靶標。同時依據世界衛生組織推薦的MERS－CoV實驗室診斷標準及中國疾病預防控制中心2015年頒發的MERS－CoV感染實驗室檢測指南：臨床病例樣本進行核酸檢測時，檢測兩個靶標同時陽性方可確認為MERS－CoV感染陽性。本實驗室在前期工作基礎上，通過熒光探針與反應體系的優化，本研究首次報道了基于MERS－CoV三個靶標（upE，ORF1b，N2）的雙重或三重熒光定量RT－PCR檢測方案，并采用病毒培養物與臨床樣本對新建立的多重核酸檢測技術進行驗證，表明其檢測靈敏度（最低檢測限為10PFU／ml）、特異性與重復性均較好，與前期建立的基于upE或N2的單重熒光定量RT－PCR檢測相當，尤其是含N2靶標（N2／upE或N2／upE／ORF1b）的多重熒光定量RT－PCR，可以檢出輸入性MERS冠狀病毒病人的全血樣品中的低拷貝核酸，更適用于臨床樣品的初篩和確認實驗。新發傳染病出現時，由于其流行病學、病理學臨床特征尚不明確，嚴重影響公共衛生安全和社會穩定，實驗室作為臨床科室不可缺少的后備檢測力量應該有能力及時為新發傳染病的診斷提供有效的手段。本實驗室建立了三種新的多重熒光定量RT－PCR檢測方案，為MERS－CoV感染提供了快速、靈敏及特異的實驗室篩查與確診工具，可以及時的為臨床診斷提供實驗室依據，這些新的實驗方法的推廣應用能夠進一步提高公共衛生實驗室的應對與防控MERS－CoV感染與傳播的能力。

作者：牛培華 陸柔劍 藍佳明 劉高山 王文玲 譚文杰 單位：中國疾病預防控制中心 病毒病預防控制所；衛生部醫學病毒和病毒病重點實驗室