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《海洋漁業(yè)雜志》2015年第六期

暗紋東方鲀(Takifugufasciatus)隸屬鲀形目(Tetraodontiformes)，鲀科(Tetrodantidae)，東方鲀屬，是一種典型的溯河洄游魚類，也是東方鲀屬中最能適應淡水生活的少數魚類之一。因暗紋東方鲀具有體型較大、生長速度較快、肉質鮮嫩以及較高的市場價值等優(yōu)勢，目前已經成為我國主養(yǎng)河鲀魚種類之一。近年來，國內暗紋東方鲀養(yǎng)殖業(yè)的發(fā)展很快。科研方面，1958年，黃海水產研究所首先在國內開展了暗紋東方鲀的人工繁殖實驗研究，隨后浙江、山東、河北、上海、江蘇等省市高校和研究所陸續(xù)開展了暗紋東方鲀的人工繁殖和育苗工藝探索，90年代后，南京師范大學、上海市水產研究所等單位對暗紋東方鲀的全人工繁殖研究獲得成功，以上成果為暗紋東方鲀規(guī)模化養(yǎng)殖和增殖保護奠定了基礎。暗紋東方鲀作為一種典型的廣鹽性硬骨魚類，具有適應水環(huán)境中廣泛鹽度的能力。廣鹽性魚類的鹽度適應機制是一個復雜的過程，涉及到魚體內一系列滲透調節(jié)組織及器官應對鹽度變化而產生的生理反應。廣鹽性魚類耐鹽性研究是魚類基礎生物學的重要組成部分，它有助于深化我們對從基因調節(jié)和信號轉導到離子運輸、滲透調節(jié)和無機營養(yǎng)這一過程的認識。到目前為止，國內外學者已相繼開展了暗紋東方鲀滲透壓調節(jié)機制的相關研究，這些研究結果有助于暗紋東方鲀的苗種培育、規(guī)模化養(yǎng)殖以及養(yǎng)殖區(qū)域的擴大。本文將從滲透壓調節(jié)相關的分子、細胞、組織器官和系統(tǒng)等水平總結近年來有關暗紋東方鲀滲透壓調節(jié)的研究進展。

1滲透壓調節(jié)的組織和器官

體外水環(huán)境的變化直接影響魚的體液滲透壓進而影響魚的存活、生長以及繁殖，因此魚類必須通過調節(jié)體內水分和鹽分平衡以維持體內滲透壓平衡。暗紋東方鲀具有很強的滲透壓調節(jié)能力，且形成了較高級的滲透壓調節(jié)機制，滲透壓調節(jié)由鰓、腎和腸對離子和水的共轉運來完成。鰓是魚類滲透壓調節(jié)和離子運輸的主要器官，鰓上皮的泌氯細胞中含有大量的Na+，K+-ATPase，該酶是氯細胞離子轉運的關鍵酶，其含量和活力依環(huán)境鹽度變化而發(fā)生變化;暗紋東方鲀、紅鰭東方鲀(T．rubripes)和星點東方鲀(T．niphobles)等6種東方鲀屬魚類均具有腎小球腎單位，但僅暗紋東方鲀具有遠端段的淡水魚型腎單位，遠端部分的存在是暗紋東方鲀適應廣泛鹽度環(huán)境的最重要因素之一。當環(huán)境鹽度過高時，魚體內腸上皮細胞吸收大量的海水以補充丟失的水分，同時利用鰓的泌氯細胞分泌過多的離子。與之相反，當遇到低滲環(huán)境如淡水時，將會吸收過多的水分并產生離子擴散丟失現象，為了保持體內滲透壓平衡，需要通過腎組織和膀胱排出體內過多水分同時利用鰓組織主動吸收外界離子。

2滲透壓調節(jié)機制

暗紋東方鲀在其生活史的不同時期分別生活在淡水或海水中，能適應較大的鹽度變化，并維持體內相對穩(wěn)態(tài)。它們依靠自身逐漸進化形成的生理機制來平衡因體外水環(huán)境中鹽度改變而產生的滲透壓變化。其中主要的滲透壓調節(jié)機制具體涉及到以下4個層面:激素、細胞、離子通道蛋白和基因。

2．1激素水平調節(jié)腎上腺髓質素(AM)是KITAMURA等首先在人手術切除的嗜鉻細胞瘤組織中分離出來的一種具有擴血管和利尿活性的多肽。它與降血鈣素基因相關肽(CGRP)結構相似，并且屬于相同的肽家族。CGRP和AM共享一個G蛋白偶聯核心受體，即降血鈣素受體樣受體(CLRs)，該受體與受體活性激素蛋白(RAMPs)相互作用決定其特異性。暗紋東方鲀含有5個腎上腺髓質素基因(AM1-5)，在其鹽度適應實驗過程中，NAG等研究發(fā)現，利用RAMPs和CLRs的可能性組合轉染COS7細胞，陽性反應的組合可引發(fā)環(huán)腺苷酸(cAMP)對于不同生理濃度的AMs的反應，結果如下:CLR1-RAMP2a/2b/3/5(AM1)，CLR2-RAMP2a/2b(AM1)，CLR1-RAMP3(AM2)，CLR1-RAMP3(AM5)。暗紋東方鲀體內的CLR1-RAMP5型AM1在鰓組織中表達，表明AM1在滲透調節(jié)過程中起作用;CLR1-RAMP2a型AM1集中定位在暗紋東方鲀腎組織的特定區(qū)域，且在腎小球過濾和腎小管的重吸收過程中扮演著重要的調節(jié)性角色。另外HINO等研究發(fā)現，AM1包含在腎小球濾過液中，除了具有分泌功能外，還可以作為一種激素起作用。

2．2細胞水平調節(jié)氯細胞高度富集于魚的鰓絲上皮，并在魚類滲透調節(jié)中起到了重要作用。BONGA等根據氯細胞生長周期各階段的超微結構特點，將氯細胞分為附細胞、不成熟細胞、成熟細胞以及退化細胞，其中只有成熟細胞才具有完全的離子轉運能力。氯細胞個體較大，且具有大量的線粒體，因此又稱為線粒體豐富細胞，可為離子的逆濃度梯度的跨膜主動運輸提供能量;氯細胞除頂端區(qū)域較窄外，整個胞質充滿著發(fā)達的呈分枝狀的微小管系統(tǒng)，且分布有大量的與轉運功能相關的Na+，K+-ATPase。氯細胞不僅能夠在淡水中吸收少量的離子，還能在海水中分泌大量的鹽。氯細胞隨魚類生存環(huán)境的改變而呈現出體積、數量、結構復雜程度等一系列的變化，從而引起鰓對離子轉運方式及能力上的改變。淡水條件下，暗紋東方鲀幼魚的血漿滲透壓和鰓絲Na+，K+-ATPase活性皆處于較低水平;轉移到鹽度10海水后，氯細胞的數目較淡水中有所增加，血漿滲透壓呈現出上升趨勢;轉移到鹽度20海水后，氯細胞發(fā)生皺縮，血漿滲透壓上升程度更為劇烈;轉移到鹽度30海水后，氯細胞內部線粒體數目增多，血漿滲透壓值迅速升高，與其它鹽度組存在顯著差異，鰓絲Na+，K+-ATPase活性也達到最高。

2．3離子通道蛋白水平調節(jié)目前有關暗紋東方鲀滲透壓調節(jié)的離子通道蛋白包括Na+，K+-ATPase、NBCe1、Slc26a6A等，其表達水平調節(jié)見表1，每種離子通道蛋白在應對鹽度變化時都顯現出不同的表達特性。

2．3．1Na+，K+-ATPase(NKA)NKA是一種能夠產生離子和電勢梯度并用于離子運輸的關鍵酶，不僅對維持細胞內環(huán)境穩(wěn)定至關重要，而且可為魚類上皮細胞中的離子轉運提供動力支持。該跨膜多次的整合膜蛋白由2個亞基(α和β)組成，主要分布于鰓上皮的氯細胞中。暗紋東方鲀幼魚鰓絲的NKA活力在淡水條件下處于較低水平，鹽度升高后，各試驗組NKA活力呈現出不同程度的上升趨勢。

2．3．2HCO3－轉運體(NBCe1/Slc26a6A和Slc26a6B)HCO3－轉運體主要分布在SLC4和SLC26兩個基因家族中，其中，SLC4家族有10個基因成員，NBCe1則是這些基因的表達產物之一。生電型的Na+－HCO3－共轉運體NBCe1，位于腸上皮細胞的基底外側膜上，不僅在腸上皮細胞HCO3－分泌過程中扮演著重要的角色，同時對于暗紋東方鲀適應海水環(huán)境亦至關重要。再者，從淡水轉移到海水后，暗紋東方鲀腸組織中的NBCe1基因高度表達，且有顯著差異。

2．3．3SO42－轉運體(Slc26a6A)SO42－是海洋中含量僅次于Cl－的陰離子，海洋魚類通過腎組織分泌體內過量的SO42－，使其保持正常的生理濃度，這對于魚類的存活是必須的。Slc26a6A是一個生電型的Cl－/SO42－交換體，間接通過Na+泵(Na+，K+-ATPase)驅動，在海洋性硬骨魚類腎近端小管細胞頂端區(qū)域，在分泌過量SO42－的過程中扮演著重要的角色。在暗紋東方鲀適應海水的實驗過程中，WATANABE等和KATO等的研究結果表明，Slc26a6A是魚類適應海水的關鍵分子之一。此外，在東方鲀屬基因組Slc13和Slc26的家族中，海水條件下暗紋東方鲀腎組織中的mfSlc26a6A因其表達水平變化較顯著，是最有可能的SO42－轉運體。

2．3．4Mg2+轉運體(Slc41a1/cyclinM3)Mg2+是海水中除了Na+之外含量最高的陽離子，海洋性硬骨魚類通過飲用海水并分泌離子以維持體內水分和離子平衡。暗紋東方鲀含有5個Slc41(Slc41a1、Slc41a2a、Slc41a2b、Slc41a3a和Slc41a3b)基因家族成員，但將暗紋東方鲀從淡水轉移到海水后，僅有Slc41a1基因在腎組織中高度表達。ISLAM等通過原位雜交和免疫組化法分析發(fā)現，離子轉運體Slc41a1位于近端小管頂端胞漿的液泡中，通過調節(jié)細胞質基質到液泡內腔的Mg2+轉運以控制Mg2+的分泌。細胞周期蛋白M(CyclinM，Cnnm)是一種古老的保守域蛋白。暗紋東方鲀中包含6個細胞周期蛋白M的家族成員:2個Cnnm1的直系同源物，1個Cnnm2、1個Cnnm3和2個Cnnm4的直系同源物。海洋硬骨魚類的腎是Mg2+分泌的主要場所，并產生帶有高濃度Mg2+的尿液。qRT-PCR分析表明Cnnm2、Cnnm3和Cnnm4a基因在海水暗紋東方鲀腎臟中表達，然而只有Cnnm3基因表達上調，且具有顯著差異。ISLAM等通過原位雜交和免疫組化法分析海水條件下暗紋東方鲀的腎組織，發(fā)現Cnnm3基因在近端小管表達，其產物位于側膜。以上研究結果表明Cnnm3在海洋硬骨魚類體液的Mg2+平衡中扮演著重要的角色。

2．3．5Ca2+轉運體(NCX2a)NCX是一個膜蛋白家族，按其分類亦可作為溶質轉運體8(TheSodium/CalciumExchangerFamily，SLC8)家族。暗紋東方鲀中包含7個NCX基因(NCX1a、NCX1b、NCX2a、NCX2b、NCX3、NCX4a和NCX4b)家族成員。海洋魚類必須飲用海水以攝取水分，然而吸收海水的同時大量離子亦隨之進入，因此海水硬骨魚類需要通過腸和腎組織分泌過量的Ca2+以維持體內Ca2+的平衡。在暗紋東方鲀鹽度適應實驗中，ISLAM等通過原位雜交和免疫組化法分析表明，NCX2a在腎組織近端小管的頂膜上表達;并且，NCX基因家族成員在不同組織中的qRT-PCR分析亦表明僅有NCX2a在海水暗紋東方鲀腎組織中高度表達。以上研究結果證明NCX2a調節(jié)腎臟Ca2+的分泌，并且在海洋性硬骨魚體內Ca2+平衡上起著重要的作用。

2．3．6水通道蛋白水通道蛋白是整合膜蛋白，屬于主體內在蛋白(MIP)家族，水通道蛋白選擇性的指導水分子進出細胞，同時阻礙離子和其它溶質的通道，對于各種器官中的液體運輸機制有重要影響。水通道蛋白家族包括傳統(tǒng)的水選擇性通道蛋白(如AQP1)以及水－甘油跨膜輸送的蛋白(如AQP3)。在暗紋東方鲀鹽度適應實驗中，AQP3在鰓組織中為水的進出提供了通道，故相對于其它組織AQP3基因在鰓上表達水平較高;與之相反，AQP1在暗紋東方鲀鰓組織的滲透調節(jié)功能上具有限制性，但其基因在海水條件下的腎組織中高度表達。當暗紋東方鲀由高鹽度轉移到低鹽度環(huán)境時，除了利用身體排水來調節(jié)滲透入水外，還通過鰓組織維持滲透壓平衡，AQP3和AQP1亦通過其基因表達水平的變化來應對鹽度變化。

2．3．7Na+/K+/2Cl－轉運體(NKCC)和Na+/Cl－轉運體(NCC)NKCC是一種跨膜蛋白，該蛋白穿過膜運輸Na+、K+和Cl－。因這些離子以相同的方向移動，故NKCC也被稱為協(xié)同轉運子。鈉氯協(xié)同轉運蛋白NCC是電中性的陽離子結合氯離子的轉運蛋白，也稱為鈉氯離子同向轉運體，具有腎臟中再吸收鈉及氯離子的功能。在暗紋東方鲀鹽度適應實驗中，KATO等的研究結果表明，遠端腎單位中NaCl的重吸收在淡水中由NKCC2(NKCC其中一種亞型)和NCC共同控制，海水中則單獨由NKCC2調控。

2．4基因水平調節(jié)鹽度脅迫的許多生理性適應是通過基因表達水平的變化來調控的，許多研究已驗證了廣鹽性魚類應對滲透脅迫的滲透壓調節(jié)機制是至關重要的。如與暗紋東方鲀近緣的紅鰭東方鲀，將其由海水轉移到咸淡水中，通過滲透調節(jié)器官(鰓、腎、腸)中催乳素受體(PRLR)基因表達水平的變化以維持體內滲透壓平衡。目前，暗紋東方鲀在鹽度脅迫中高度表達或被抑制表達的離子轉運和激素基因研究已有報道。

2．4．1離子轉運基因NKA基因編碼的蛋白質對于細胞內包含相對較高濃度的K+和較低濃度的Na+有重要意義。JEONG等研究發(fā)現，淡水條件下暗紋東方鲀幼魚不同器官中的NKA表達量有顯著性差異，海水條件下鰓和腸之間無差異，而兩組織和腎間均差異顯著。NKA主要分布在鰓組織，幼魚從淡水轉移到海水，初始時表達量急劇上升達到最高值，然后快速降低，最后逐漸恢復至起始值直至實驗結束。與之相反，從海水轉移到淡水，NKA表達量無顯著變化，僅僅在轉移起始時表達量有較小幅度的升高。NKCC是一種編碼跨膜蛋白的基因，該蛋白穿過膜運輸Na+、K+和Cl－。暗紋東方鲀幼魚腎組織中的NKCC2基因在遠端小管表達，且在淡水和海水條件下表達量皆較高。鈉氯協(xié)同轉運基因(NCC)在腎臟中參與編碼一種協(xié)同轉運蛋白，用于鈉離子和氯離子的重吸收。淡水條件下暗紋東方鲀幼魚腎臟組織中的NCC表達量較高，在鰓組織中表達量則較低。然而，在海水條件下，腎臟和其集合管細胞的頂端膜中NCC的表達量皆有較大程度的降低。以上研究結果表明，腎臟中NCC基因的表達與河鲀魚適應淡水之間相關聯。水通道蛋白基因(AQP)編碼一種蛋白，該蛋白位于細胞膜上，即內在蛋白，又名水孔蛋白，在細胞膜上形成孔道，可控制水的進出。AQP1在不同器官不同鹽度下的表達量均有顯著性差異，淡水和海水條件下腸中的表達量均高于鰓和腎。鰓組織中的AQP3在淡水條件下的表達量顯著高于腎臟和腸，而在海水中，各個組織器官的表達量均差異顯著。

2．4．2激素基因催乳素受體(PLR)基因編碼垂體前葉激素(催乳素)受體。淡水條件下暗紋東方鲀幼魚不同器官中的PLR基因表達量明顯不同，腎中最高;而在海水中僅有鰓的PLR表達量與其它器官有顯著性差異。PLR通過阻礙離子的丟失和水的吸收在魚類滲透壓調節(jié)過程中扮演著重要的角色。PLR能夠調節(jié)含有NKA的氯細胞的密度和數目，但是目前關于PLR對于鰓組織NKA基因所起到的調節(jié)作用仍未有明確的認識。即使暗紋東方鲀轉移到高鹽度環(huán)境下，鰓組織中NKA基因表達量急劇增加，但鰓組織中PLR基因的表達量并沒有與NKA呈現出明顯的相關性。因此，我們需進一步利用鹽度細胞的組織學標記等相關技術，來證明該物種中NKA和PLR的相互關系。

3小結與展望

暗紋東方鲀滲透調節(jié)適應機制的研究是魚類生理學上的重點研究領域之一。然而，國際上對硬骨魚類鹽度調控的相關研究更多的偏重于滲透壓調節(jié)機理研究，研究層次雖廣但深度不夠。本綜述總結了近年來有關暗紋東方鲀滲透壓調節(jié)方面的研究成果，有助于對暗紋東方鲀滲透壓調控分子機制進行深層探究，最終形成完善的系統(tǒng)性調控網絡體系，進一步深化人們對魚類滲透壓調控的認識，并為暗紋東方鲀的苗種培育、規(guī)模化養(yǎng)殖和養(yǎng)殖區(qū)域的擴大提供理論依據。對暗紋東方鲀滲透壓調節(jié)的研究需要我們挖掘更多的滲透壓調控相關基因、蛋白以及上下游通路所形成的協(xié)同調控因子。目前，由于暗紋東方鲀基因組信息缺乏，所了解的參與滲透壓調節(jié)的基因和蛋白還很有限，而與暗紋東方鲀近緣的紅鰭東方鲀已有全基因組序列，其滲透壓相關基因和蛋白也已得到深入研究。因此今后需加強暗紋東方鲀基因組學的研究，同時需聯合轉錄組和蛋白質組學闡明暗紋東方鲀的滲透壓分子調節(jié)機理，以便更全面理解和揭示暗紋東方鲀的滲透壓調節(jié)機制，從而為我國河鲀養(yǎng)殖產業(yè)可持續(xù)發(fā)展提供理論支撐。

作者：王麗 王小魯 梁奮飛 尹紹武 錢曉明 盧玉平 單位：南京師范大學生命科學學院 江蘇省生物多樣性與生物技術重點實驗室 江蘇中洋集團股份有限公司